【摘要】：研究背景:川崎病(Kawasaki disease,KD)是一種全身性自限性血管炎,主要發(fā)生于5歲以下的兒童。該疾病的主要且嚴(yán)重的并發(fā)癥是冠狀動脈病變(coronary artery leision,CAL),CAL被認(rèn)為是目前兒童獲得性心臟病的主要原因。在全球范圍內(nèi),中國兒童川崎病發(fā)病率僅次于韓國和日本,居第三位。川崎病首例報告至今已有50年,盡管該病的病因不是太明確,但有研究表明川崎病多發(fā)生于有遺傳易感性的兒童,并在某些特定的感染原作用下發(fā)病。異常免疫反應(yīng)也被認(rèn)為是該疾病臨床前期和急性期的關(guān)鍵。急性期大劑量靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)以及中至高劑量阿司匹林是目前治療的黃金標(biāo)準(zhǔn)。盡管IVIG作用的具體機(jī)制仍不清楚,但其廣泛的抗炎作用被認(rèn)為是治療川崎病的一個重要因素。然而,大約20%的川崎病患兒對大劑量IVIG沒有明顯反應(yīng),表現(xiàn)為發(fā)熱不退和炎性指標(biāo)不下降。另外,對初始IVIG治療反應(yīng)失敗后的替代療法目前國內(nèi)外沒有確定的統(tǒng)一方案,導(dǎo)致CAL的發(fā)病率居高不下。因此,尋找更有效治療方案是非常有必要的。環(huán)氧二十碳三稀酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)是一種環(huán)氧脂肪酸,EETs能以自分泌和旁分泌的形式在病理生理條件下發(fā)揮很多的生物學(xué)作用,包括抗炎、抗凋亡、抗纖維化、抗氧化劑等,另外有證據(jù)表明EETs在多種心血管疾病中有保護(hù)作用,包括減輕心臟損傷、抗高血壓、促進(jìn)血管修復(fù)等作用。然而EETs在體內(nèi)能被可溶性環(huán)氧化物水解本科(soluble epoxide hydrolase,sEH)快速水解為無活性的碳十三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids,DHETs)。而可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑(sEH inhibitors,sEHi)可以通過抑制這個途徑能夠有效增加血漿和組織中EETs的含量,從而增強(qiáng)EETs的各種生理學(xué)作用。12-(3-adamantan-1-yl-ureido)-dodecanoic acid(AUDA)是一種可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑,可以通過抑制sEH的水解作用從而增加EETs的含量,增強(qiáng)EETs的抗炎及血管修復(fù)作用。新近研究表明,AUDA除了有抑制sEH的作用外,它自身還有抗炎和降壓的作用。而AUDA是否對川崎病血管炎反應(yīng)和冠脈損傷有保護(hù)作用尚未見報道。目的:1.研究AUDA對人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(human coronary arterial endothelial cells,HCAECs)遷移、粘附、增殖和新生血管形成功能的影響及機(jī)制,探討AUDA是否具有促進(jìn)血管修復(fù)的作用。2.研究AUDA對川崎病小鼠心臟組織及血管病理及炎癥因子的影響,探討AUDA是否具有抗血管炎的作用。3.研究EETs在川崎病患兒外周血中的表達(dá)變化及臨床意義。方法:1.AUDA對HCAECs細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖及血管生成功能的影響及可能機(jī)制研究1.1 將不同濃度的(0、1、10、50、100、100μmol/L+5 μmol/LGW9662)AUDA處理的HCAECs添加至transwell板上層,檢測sEHi對HCAECs細(xì)胞遷移功能的影響;1.2 將不同濃度AUDA(0、1、10、50、100、100 μmol/L+5pmol/L GW9662)干預(yù)的HCAECs加入人纖維連接蛋白包被的96孔培養(yǎng)板,檢測sEHi對HCAECs細(xì)胞粘附功能的影響;1.3 采用CCK-8法檢測不同濃度AUDA(0、1、10、50、100、100 pmol/L+5 pmol/L GW9662)對HCAECs細(xì)胞增殖功能的影響;1.4 將不同濃度AUDA(0、1、10、50、100、100 μmol/L+5 μmol/LGW9662)處理的HCAECs加入Matrigel包被的96孔培養(yǎng)板,檢測sEHi對HCAECs細(xì)胞血管生成功能的影響。1.5采用實時熒光定量RT-PCR法和ELISA法檢測100 μmol/L AUDA干預(yù)后PPARγ的表達(dá)變化;將PPARγ特異性siRNA/PPARγ過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HCAECs細(xì)胞,采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖變化,以探討AUDA在HCAECs細(xì)胞中的作用靶點和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。2.采用干酪乳桿菌細(xì)胞壁成分(LCWE)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠川崎病模型,分析AUDA對小鼠冠狀動脈炎癥反應(yīng)的影響,并進(jìn)一步從蛋白和基因水平檢測心臟組織中TNF-α、IL-1β、MMP-9炎癥因子的表達(dá)變化。2.1實驗小鼠隨機(jī)分為四組,每組5例,分別為:PBS組,LCWE組,LCWE+AUDA組,LCWE+AUDA+GW9662組;2.2分別在第3、14、28天處死小鼠,取小鼠心臟組織,一部分心臟組織立即置于-80℃冰箱保存?zhèn)錂z,一部分心臟組織石蠟包埋固定、切片,進(jìn)行HE染色,觀察小鼠心臟組織炎癥變化。2.3采用實時熒光定量RT-PCR法和ELISA法分別檢測各組小鼠心臟組織中14,15-EET的mRNA和蛋白表達(dá)水平;2.4選擇腹腔注射各組藥物后第14天的小鼠為研究對象,取小鼠心臟組織切片進(jìn)行HE染色,檢測各組小鼠心臟組織炎癥反應(yīng)變化情況;2.5選取腹腔注射各組藥物后第14天的小鼠為研究對象,采用ELISA法檢測小鼠心臟組織中TNF-α、IL-1β、MMP-9蛋白的表達(dá)變化;2.6以注射各組藥物后第14天的小鼠為研究對象,實時熒光定量RT-PCR法檢測小鼠心臟組織中TNF-α、IL-1β、MMP-9基因的表達(dá)。3.檢測EETs在川崎病患兒外周血中的表達(dá)變化及其與冠脈損傷的關(guān)系3.1收集川崎病患兒及健康對照組的外周血樣本(均簽署知情同意書),并用統(tǒng)計學(xué)方法分析各組的臨床資料;3.2分別采用實時熒光定量RT-PCR法和ELISA法檢測14,15-EET在各組樣本中的mRNA和蛋白含量,分析其與冠脈損傷的關(guān)系。3.3分別利用實時熒光定量RT-PCR法和ELISA法檢測TNF-α、IL-1β和MMP-9在各組樣本中的mRNA和蛋白含量,分析其與冠脈損傷的關(guān)系。結(jié)果:1.AUDA對HCAECs細(xì)胞遷移,細(xì)胞粘附,細(xì)胞增殖及血管生成功能的影響:1.1隨著加入AUDA濃度的增加,遷移細(xì)胞的數(shù)量逐漸增多,提示AUDA以濃度梯度的方式促進(jìn)HCAECs的遷移,與0μmol/LsEHi組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),給予PPARγ抑制劑GW9662干預(yù)后,細(xì)胞的遷移能力降低(P0.05)。1.2隨著加入AUDA濃度的增加,細(xì)胞粘附的數(shù)量逐漸增多,提示AUDA以濃度梯度的方式促進(jìn)HCAECs的粘附,與0μmol/L AUDA組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),給予PPARy抑制劑GW9662干預(yù)后,細(xì)胞的粘附能力降低(P0.05)。1.3隨著加入AUDA濃度的增加,OD值逐漸升高,提示AUDA以濃度梯度的方式促進(jìn)HCAECs的增殖,與Oμmol/LAUDA組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)給予PPARy抑制劑GW9662干預(yù)后,細(xì)胞的增殖能力降低(P0.05)。1.4隨著加入AUDA濃度的增加,測量的血管主干長度逐漸增長,提示AUDA以濃度梯度的方式促進(jìn)HCAECs的血管生成能力,與Oμmol/L AUDA組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),給予PPARγ抑制劑GW9662干預(yù)后,細(xì)胞的血管生成能力有所降低(P0.05)。1.5加入100μmol/LAUDA顯著增強(qiáng)了HCAECs中PPARy的表達(dá)水平(P0.01),PPARγ敲降組細(xì)胞增殖能力顯著下降(P0.05),而PPARγ過表達(dá)作用則相反(P0.01),100μmol/LAUDA增強(qiáng)了細(xì)胞增殖能力(P0.01);在 100μmol/LAUDA干預(yù)的細(xì)胞中敲降PPARγ后,細(xì)胞增殖能力降低(P0.05)。上述結(jié)果提示,AUDA可能通過上調(diào)PPARγ促進(jìn)人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。1.6 100μmol/L AUDA干預(yù)人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞或過表達(dá)PPARγ后,STAT1 mRNA水平顯著下降(P0.05);而PPARy敲降組STAT1 mRNA水平顯著上升(P0.01)。在100μmol/LAUDA干預(yù)的細(xì)胞中敲降PPARγ后,STAT1表達(dá)上升到對照組水平(P0.05)。上述結(jié)果表明,AUDA可能通過上調(diào)PPARy抑制JAK/STAT1信號通路,進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。2.采用干酪乳桿菌細(xì)胞壁成分(LCWE)腹腔注射建立C57BL/6小鼠川崎病模型,探討AUDA對小鼠冠狀動脈炎癥的影響,并進(jìn)一步從蛋白和基因水平檢測心臟組織中TNF-α、IL-1β、MMP-9炎癥因子的表達(dá)變化。2.1心臟組織病理切片結(jié)果顯示:PBS組小鼠,心臟組織沒有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤,而LCWE組小鼠,第14天炎癥細(xì)胞浸潤明顯。脾臟組織病理切片顯示:PBS組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)清楚,脾小體結(jié)構(gòu)完整,而LCWE組小鼠脾小體增生、融合,以14天最明顯。2.2實時熒光定量RT-PCR和ELISA結(jié)果顯示,注射LCWE后第3天14,15-EET的表達(dá)水平顯著升高,第14天表達(dá)水平下降,第28天基本降至正常對照水平(P0.05)。2.3以注射各組藥物后第14天的小鼠為研究對象,PBS組小鼠,心臟組織沒有發(fā)現(xiàn)有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤,而LCWE組小鼠,冠狀動脈周圍有明顯炎癥細(xì)胞浸潤,LCWE+AUDA組,有少許炎癥細(xì)胞浸潤,而LCWE+AUDA+GW9662組,與LCWE+AUDA組相比,炎癥細(xì)胞浸潤增多。2.4以注射各組藥物后第14天的小鼠為研究對象,LCWE組小鼠心臟組織中TNF-α、IL-1β、MMP-9的蛋白水平均高于PBS組,LCWE+AUDA組TNF-α、IL-1 β、MMP-9的蛋白水平均低于LCWE組;而LCWE+AUDA+GW9662組,與LCWE+AUDA組相比,TNF-α、IL-1β、MMP-9的蛋白水平增高(P0.05)。2.5以注射各組藥物后第14天的小鼠為研究對象,與PBS組相比,LCWE組小鼠心臟組織中TNF-α、IL-1β、MMP-9的基因水平顯著升高;LCWE+AUDA組中TNF-α、IL-1β、MMP-9的基因水平均低于LCWE組;而與LCWE+AUDA組相比,LCWE+AUDA+GW9662組中TNF-α、IL-1β、MMP-9的基因水平增高(P0.05)。3.EETs在川崎病患兒外周血中的表達(dá)變化及臨床意義:3.1與健康對照組相比,14,15-EET在川崎病患兒外周血中表達(dá)增強(qiáng)(P0.01)。3.2與無冠脈損傷的川崎病患兒相比,14,15-EET在發(fā)生冠脈損傷的川崎病患兒外周血中高表達(dá)(P0.05)。3.3與健康對照組相比,TNF-α、IL-1β和MMP-9在川崎病患兒外周血中的表達(dá)水平顯著上調(diào);與無冠脈損傷的川崎病患兒相比,在發(fā)生冠脈損傷的川崎病患兒外周血中異常高表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:1.AUDA能夠促進(jìn)人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能,促進(jìn)血管修復(fù);2.AUDA能夠減輕川崎病小鼠心臟組織的炎癥反應(yīng);3.AUDA發(fā)揮上述作用可能是通過PPARy/STAT1信號通路實現(xiàn)的;4.川崎病患兒外周血EETs表達(dá)升高;合并冠脈病變者表達(dá)水平更高,提示EETs對川崎病患兒可能有保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R725.4
【圖文】：

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本文編號：2774532