【摘要】：在過去20年里,大量研究證實世界范圍內(nèi)過敏性疾病的發(fā)病率逐年增加,其原因不十分清楚�！靶l(wèi)生假說”為兒童在生命早期缺乏微生物的暴露導致今后過敏性疾病的發(fā)生進行了解釋,由于缺乏微生物刺激導致Th1/Th2平衡紊亂和調(diào)節(jié)性T細胞功能低下。越來越多研究認為,兒童早期缺乏微生物接觸導致的過敏與今后發(fā)生哮喘和過敏性疾病的風險密切相關。雖然過敏和哮喘具有遺傳傾向性,但基因與環(huán)境的相互作用更能解釋發(fā)病機制。環(huán)境因素如感染、接觸過敏原以及產(chǎn)前因素如母親吸煙、孕期營養(yǎng)、產(chǎn)婦精神壓力、分娩方式和新生兒期應用抗生素等均會影響小兒今后過敏性疾病和支氣管哮喘的發(fā)生。通過基因與環(huán)境的相互作用、表觀遺傳學以及分子生物學深入研究,力圖解開假定風險與過敏性疾病和支氣管哮喘發(fā)生的關聯(lián)。有關哮喘和過敏性紫癜的流行病學資料、危險因素調(diào)查以及病理機制有待進一步解釋,了解這些機理對減少哮喘發(fā)生風險及尋找切實有效的藥物干預微生態(tài)生境,調(diào)整免疫功能對過敏性疾病的預防是十分必要的。 第一部分:腸道微生態(tài)學變化、CD4+T細胞亞群及相應轉(zhuǎn)錄因子在兒童支氣管哮喘病理機制中的調(diào)控作用 目的:探討腸道微生態(tài)環(huán)境變化以及免疫網(wǎng)絡結(jié)構中CD4+T亞群及相應細胞因子和上游轉(zhuǎn)錄因子在支氣管哮喘病理機制中的相互調(diào)控作用。 方法:采用流式細胞術(Flow cytometry,FCM)對47例支氣管哮喘患兒和32例健康對照組兒童外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell , PBMC )測定CD3+CD8-INF-γ+ IL-4- ( Th1 )、CD3+CD8-INF-γ- IL-4(+Th2)、CD4+CD25+T細胞(Treg)和CD3+CD8-IL-17+( Th17)細胞百分比;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗( Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定血漿中細胞因子INF-γ、IL-4、TGF-β1和IL-17水平;T-bet是調(diào)控Th1細胞分化、GATA3是調(diào)控Th2細胞分化、Foxp3是調(diào)控調(diào)節(jié)性T細胞分化、ROR-γt是Th17分化的關鍵性轉(zhuǎn)錄因子,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應( Reverse transcription-polymerase chain reaction ,RT-PCR)檢測外周血單個核細胞內(nèi)T-bet、GATA3、Foxp3和ROR-γt mRNA的表達;采用細菌16S rDNA方法測定糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和腸球菌含量。 結(jié)果:支氣管哮喘患兒在急性發(fā)作期時發(fā)生腸道菌群失調(diào),表現(xiàn)在雙歧桿菌和乳酸桿菌為代表的厭氧菌數(shù)量下降,大腸桿菌和腸球菌為代表的需氧菌數(shù)量變化不大,雙大腸桿菌歧桿菌/(Bifidobacteria/ escherichia coli, B/E)值下降。隨著治療和癥狀改善,恢復期時雙歧桿菌數(shù)量上升較其他細菌為快,但整體菌群結(jié)構并未扶正。對于免疫學指標的觀察發(fā)現(xiàn),支氣管哮喘患兒在急性發(fā)作期時外周血PBMC中Th2和Th17細胞百分比以及血漿中Th2和Th17細胞因子IL-4和IL-17濃度均高于健康對照組;Th1和Treg細胞百分比以及血漿中Th1和Treg細胞因子INF-γ和TGF-β1濃度均低于健康對照組,出現(xiàn)Th1/Th2和Treg/Th17失衡。緩解期Th2和Th17細胞百分比及血漿相應細胞因子濃度隨疾病的回復而降低,但仍高于健康對照組,仍存在免疫紊亂。支氣管哮喘患兒Th1細胞與血漿中INF-γ濃度和外周血PBMC中T-bet表達呈正相關;Th2細胞與血漿中IL-4濃度和外周血PBMC中GATA3表達呈正相關;Treg細胞與血漿中TGF-β1濃度和外周血PBMC中Foxp3表達呈正相關;Th17細胞與血漿中IL-17濃度和外周血PBMC中ROR-γt表達呈正相關,表明Th1/Th2和Treg/Th17主要受其特異性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。腸道菌群中B/E值與Th1/Th2和Tregs/Th17之間均呈正相關關系。 結(jié)論:Th1/Th2細胞分化失衡在支氣管哮喘發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用,除了Th2細胞免疫應答活躍外,調(diào)節(jié)性T細胞以及Th17細胞也參與了在支氣管哮喘的發(fā)病過程中,表明除了經(jīng)典的Th1/Th2免疫失衡外,還存在Treg/Th17免疫失調(diào)。腸道共生菌刺激機體免疫系統(tǒng)的發(fā)育,在支氣管哮喘中通過下調(diào)Th2應答,糾正Th1/Th2失衡。腸道菌群結(jié)構和功能的完整性對維系CD4+CD25+T細胞功能發(fā)重要作用,支氣管哮喘患兒腸道菌群失調(diào)損傷了CD4+CD25+T細胞的免疫抑制功能,導致免疫耐受被打破是支氣管哮喘病理過程的重要機制。其研究結(jié)論為今后藥品的開發(fā)和應用,并在早期及時恢復腸道微生態(tài)平衡,阻斷異常免疫的某個環(huán)節(jié),防治支氣管哮喘提供了重要理論依據(jù)。 第二部分:腸粘膜屏障功能、CD4+T細胞亞群及相應轉(zhuǎn)錄因子在兒童過敏性紫癜病理機制中的調(diào)控作用 目的:探討腸粘膜屏障功能變化及其免疫網(wǎng)絡中CD4+T亞群及相應細胞因子和特異性轉(zhuǎn)錄因子在過敏性紫癜病理機制中的相互調(diào)控作用。 方法:采用流氏細胞術測定41例過敏性紫癜患兒和30例健康兒童外周血單個核細胞CD3+CD8-INF-γ+ IL-4(-Th1), CD3+CD8-INF-γ- IL-4+(Th2),CD4+CD25+T細胞(Treg)和CD3+CD8-IL-17+(Th17)細胞百分比;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血漿中INF-γ、IL-4、TGF-β1、IL-9和IL- 17細胞因子水平;T-bet是調(diào)控Th1細胞分化,GATA3是調(diào)控Th2細胞分化,Foxp3是調(diào)控調(diào)節(jié)性T細胞分化,ROR-γt是控制Th17分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子,由逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測外周血PBMC內(nèi)T-bet、GATA3、Foxp3和ROR-γt mRNA表達;采用細菌16S rDNA方法測定糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和腸球菌含量。采用液相色譜儀測定尿中乳果糖(lactulose, L)與甘露醇(mannito, M)水平,計算L/M值評價腸粘膜通透性。 結(jié)果:過敏性紫癜患兒在急性期即發(fā)生腸道菌群失調(diào),表現(xiàn)為腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌下降,大腸桿菌和腸球菌減少不明顯,以乳酸桿菌數(shù)量下降為顯著。治療后隨著臨床癥狀的改善,恢復期時雙歧桿菌數(shù)量上升較乳酸桿菌為快,腸道仍處于微生態(tài)紊亂狀態(tài),并且腸道中乳酸桿菌數(shù)量和B/E值和尿L/M值呈負相關。在過敏性紫癜急性期時,外周血PBMC中Th2和Th17細胞亞群百分比以及血漿中IL-4、IL-17水平和特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3、ROR-γt mRNA表達均高于健康對照組;Th1和Treg細胞百分比以及血漿中INF-γ、TGF-β1水平和特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Foxp3 mRNA表達均低于健康對照組,出現(xiàn)Th1/Th2和Treg/Th17免疫失衡�；謴推跁rTh2和Th17細胞百分比及IL-4、IL-17水平和特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3和ROR-γt表達有所下降,但仍存在Th1/Th2、Treg/Th17免疫失衡。過敏性紫癜患兒血漿中INF-γ與外周血PBMC中Th1細胞百分比、T-bet表達呈正相關;IL-4與外周血PBMC中Th2細胞百分比、GATA3表達呈正相關;TGF-β1與外周血PBMC中Treg細胞百分比、Foxp3表達呈正相關;IL-17與外周血PBMC中Th17細胞百分比、ROR-γt表達呈正相關。腸道菌群中B/E值和乳酸桿菌數(shù)量分別與Th1/Th2和Tregs/Th17呈正相關,與尿L/M比值呈負相關。 結(jié)論:過敏性紫癜患兒在急性期出現(xiàn)腸道微生態(tài)失衡,表現(xiàn)在腸道菌群B/E值下降,乳酸桿菌數(shù)量下降尤為顯著,腸粘膜通透性下降,腸粘膜屏障功能遭到損壞,腸道共生菌所誘導的免疫耐受機制被打破,表現(xiàn)在外周血PBMC中CD4+CD25+T細胞百分比降低及其血漿TGF-β1水平降低,轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達下降,對以往經(jīng)典的Th1/Th2細胞免疫失衡的發(fā)病理論進行了修訂,認為過敏性紫癜的發(fā)病機制除了有Th1/Th2免疫失衡外,也存在Treg/Th17的免疫失調(diào),并參與了疾病的病理過程。腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌在恢復機體免疫自穩(wěn)狀態(tài),誘導免疫耐受方面發(fā)揮重要作用。研究結(jié)論從微生態(tài)學和免疫學角度闡明了過敏性紫癜的發(fā)病機制,探討了腸道共生菌、免疫細胞、細胞因子以及轉(zhuǎn)錄因子在疾病發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用,為今后藥品的開發(fā)不僅限于調(diào)整宿主的免疫功能,更要放眼于改善腸道微生態(tài)環(huán)境,為過敏性紫癜的臨床治療提供前期的理論依據(jù)。 第三部分參芪健脾方對腸道菌群失調(diào)大鼠腸粘膜屏障功能修復及免疫功能調(diào)整作用機制的實驗研究 目的:前兩部分研究已表明兒童過敏性疾病如支氣管哮喘和過敏性紫癜的病理過程均發(fā)生腸道微生態(tài)失調(diào)和免疫調(diào)控機能失衡,故尋求改善微生態(tài)生境,調(diào)節(jié)免疫功能的藥物,早期阻斷疾病的惡性循環(huán),防治過敏性疾病十分重要。本實驗探討參芪健脾方對腸道菌群失調(diào)大鼠修復腸粘膜屏障功能、抑制腸道細菌移位和調(diào)整免疫功能的作用機制研究,對開發(fā)中藥方劑防治過敏性疾病具有重要臨床價值。 方法:采用細菌培養(yǎng)法動態(tài)測定大鼠腸道菌群結(jié)構變化及腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟和結(jié)腸組織的移位細菌量;應用光鏡和電子顯微鏡觀察大鼠腸粘膜組織超微結(jié)構變化;采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)動態(tài)測定大鼠腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟和腸粘膜組織中Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平。 結(jié)果:腸道菌群失調(diào)模型建立,大鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸桿菌數(shù)量均較對照組下降。腸粘膜組織受損,表現(xiàn)在腸絨毛、腸上皮細胞以及緊密連接的受損。大鼠體內(nèi)Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平早期受抑制,腸系膜淋巴結(jié)、腸粘膜、肝臟和脾臟組織出現(xiàn)腸道細菌移位情況。大腸桿菌攻擊可加重腸道菌群失調(diào)和腸粘膜損傷程度,上調(diào)Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平,加劇細菌移位程度。參芪健脾方和乳酸桿菌可減輕由腸道菌群失調(diào)引起的Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄受抑及細菌移位程度,扶正腸菌群結(jié)構,修復損傷的腸粘膜屏障功能。 結(jié)論:闡明了腸道菌群、腸粘膜屏障功能和腸道細菌移位以及免疫功能之間的互為因果,相互影響的關系。腸道菌群失調(diào)改變了腸道微生態(tài)生境,損傷了腸粘膜上皮細胞結(jié)構,促發(fā)腸道細菌移位,致使Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄受抑。參芪健脾方在維護機體微生態(tài)平衡、修復腸粘膜屏障功能和抑制腸道細菌移位方面相同于乳酸桿菌制劑,參芪健脾方可調(diào)整機體免疫功能,尤其是天然免疫的模式識別受體,對于過敏性疾病的早期防治具有臨床價值。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R285;R725.9

【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 鄭秀麗;基于肺腸微生態(tài)和MEK/ERK信號通路探討肺與大腸病理傳變的生物學基礎[D];成都中醫(yī)藥大學;2013年

相關碩士學位論文 前1條

1 薛平燕;腸道菌群與非酒精性脂肪性肝病的關系[D];昆明醫(yī)科大學;2013年

本文編號：2772518