【摘要】： 目的 膽道閉鎖(biliary atresia,BA)是嬰兒早期累及肝內(nèi)外膽道,最終導(dǎo)致終末期肝硬化的嚴(yán)重肝臟疾病,其特點為膽管進行性的炎癥、梗阻、纖維化,并最終消失,即使在膽道重建術(shù)后大多數(shù)患兒的肝臟病變也將繼續(xù)進展,最終約有80%的患者需肝移植。已有研究證明上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelium-mesenchymaltransition,EMT)在多種組織器官的纖維化進程中發(fā)揮重要作用,其中伴隨著胚胎發(fā)育相關(guān)基因的重新激活。因此本研究結(jié)扎幼鼠肝外膽道模擬新生兒膽道閉鎖肝纖維化,探討這一病理過程的相關(guān)分子在膽道閉鎖肝纖維化過程中發(fā)揮的作用。 材料與方法 一、動物模型的建立 選用100只3周Wistar大白鼠幼鼠,體重30-40g,健康,無明顯畸形者。隨機平均分成兩組,一組(50只)實施BDL術(shù)(近肝門端膽總管雙重結(jié)扎,結(jié)扎線之間離斷),另一組(50只)作為對照組實施假手術(shù)(開腹游離膽總管不結(jié)扎)。術(shù)后相同條件下飼養(yǎng)。 二、取材 分別于術(shù)后3d、7d、14d、21d、28d處死幼鼠,分離取出完整肝臟,統(tǒng)一取同一肝葉作為標(biāo)本,一部分固定于4%多聚甲醛留作免疫組化,另一部分冷凍于-80度留作RT-PCR。 三、指標(biāo)檢測 通過RT-PCR檢測各目的基因:炎癥相關(guān)因子TGF-β1,纖維化早期指標(biāo):COL1,膽管上皮細胞特異性細胞因子CK19,纖維化指標(biāo)α-SMA等mRNA表達水平。 結(jié)果 一、大體肝臟病理結(jié)果 BDL組:實驗組幼鼠第二天開始排黃色尿;三天后可見近肝門處較小肝葉出現(xiàn)水樣變性;7天肝臟標(biāo)本可見水樣變性范圍擴大,在此基礎(chǔ)上伴有黃色脂肪變性;14天肝臟可見水樣變性消失,脂肪變性范圍進一步擴大至較大肝葉;21天脂肪變消失,而肝臟表面出現(xiàn)均勻黃色小粟粒樣結(jié)節(jié);28天可見肝臟整體體積縮小,顏色加深變黃,可見更為顯著的黃色粟粒樣結(jié)節(jié)。 對照組:肝臟標(biāo)本各肝葉始終色澤紅潤,表面光滑,并隨著幼鼠發(fā)育逐漸增大。 二、RT-PCR結(jié)果 在假手術(shù)對照組和BDL組幼鼠肝臟中均能檢測出目的基因的表達�？梢妼φ战M目的基因mRNA擴增條帶表達較弱,在BDL組表達增強,并且隨著結(jié)扎天數(shù)的增加條帶亮度逐漸增強,尤其TGF-β1及COL1目的條帶增加趨勢明顯,對照組則未見明顯變化趨勢。統(tǒng)計分析顯示兩組TGF-β1及COL1的表達差異從3天開始有統(tǒng)計學(xué)意義,BDL組與對照組中CK19目的基因在第21天、28天表達的差異有統(tǒng)計學(xué)意義,α-SMA的表達則從第7天開始有統(tǒng)計學(xué)意義。對BDL不同天數(shù)組間的表達研究發(fā)現(xiàn)CK19在3-7天,7-14天,α-SMA在3-7天無統(tǒng)計學(xué)意義,而其他各組均有統(tǒng)計學(xué)意義,各目的基因組間表達呈增長趨勢,其中14天-21天增長速度最快,這種趨勢在α-SMA的表達中尤為明顯。 結(jié)論 通過肝外膽道結(jié)扎造成膽道梗阻的幼鼠,肝臟呈現(xiàn)膽汁淤積性、進行性加重的纖維化表現(xiàn)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)BDL組肝臟纖維化相關(guān)基因表達明顯高于對照組,并且隨著梗阻天數(shù)的增加表達量明顯增加。并且本實驗還發(fā)現(xiàn)在肝纖維化過程中的14-21天是纖維化發(fā)生的特殊時期,這一時期可能是膽管上皮發(fā)生EMT的關(guān)鍵時期。在肝臟發(fā)生纖維化過程中,由于COL1表達增強早于α-SMA,所以COL1可以做為監(jiān)測纖維化的早期指標(biāo)。在BDL導(dǎo)致肝纖維化過程中,炎癥相關(guān)因子TGF-β1可能發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R726.5
【圖文】：

:表「}’數(shù)值為目的基因與內(nèi)參照p一actin的灰度比值4，BDL組CK19、a一Sma、TGF一pl、COLI的表達水平(xCK19a一SmaTGF一pl0.81士0.25<0.050.92士0.370.58士0.27)0.05>0.051.09士0.470.69士0.210.97士0.23)0.05<0.05(0.051.16士0.210.91士0.141.12士0.321(0.05(0.05(0.051.35士0.221.43士0.181.35士0一221(0.05<0.05<0.051.49士0.211.72士0.251.49士0.21:表中數(shù)值為目的基因與內(nèi)參照p一actin的灰度比值:P值為上下兩組

RT一PCR檢測a一SMAmRNA表達水平的電泳圖

圖15，BDL組與對照假手術(shù)組a一SMAmRNA表達水平差異討論膽道閉鎖(biharyatresia，BA)是新生兒膽汁淤積性肝硬化最常見的原因，病率為1/10000一1/1400017]，不經(jīng)治療的平均生存期為1年。自1959年創(chuàng)立經(jīng)典asai根治術(shù)以來，本病預(yù)后得到極大改善，但5年生存率仍在30%左右18】。近年來BA的研究發(fā)現(xiàn)，雖然各種檢測技術(shù)在提高，相關(guān)理淪亦在不斷推進，了ll-)丙囚學(xué)

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本文編號：2766523