【摘要】：目的采集正常產(chǎn)婦臍血進行HCMV系列實驗室檢測,分析正常產(chǎn)婦分娩新生兒的HCMV先天性感染率。同時應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測正常產(chǎn)婦臍血中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞的百分比,并計算CD4+"CD8+的比值,探討HCMV先天性感染與T淋巴細胞亞群變化的相關(guān)性,進一步結(jié)合追蹤患兒的臨床表現(xiàn),為HCMV先天性感染的有效預(yù)防和免疫治療及臨床妊娠干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。 方法自2009年12月～2011年3月于合肥市婦幼保健院采集正常產(chǎn)婦36例臍血標(biāo)本,按實驗設(shè)計分別作如下處理:(1) HCMV病毒分離:取2ml臍血抗凝血,分離白細胞后接種到人胚肺成纖維細胞(HELF)培養(yǎng)物上,逐日于倒置顯微鏡下觀察HCMV致細胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect, CPE);(2)從分離的臍血白細胞中提取總DNA分別進行巢式PCR法和熒光定量PCR法檢測;(3)將分離的臍血白細胞進行HCMV-pp65抗原血癥檢測;(4)從36例臍血標(biāo)本中分別取0.5ml臍血,采用流式細胞術(shù)檢測臍血中T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的百分比,并計算CD4+"CD8+的比值,結(jié)合追蹤患兒的臨床表現(xiàn),分析新生兒HCMV先天性感染與T淋巴細胞亞群變化的相關(guān)性;(5)將巢式PCR擴增后的陽性標(biāo)本測序,并與基因數(shù)據(jù)庫序列比對,進一步證實巢式PCR擴增產(chǎn)物是HCMV gB基因。 結(jié)果(1)病毒分離:分別將36份臍血白細胞接種于HELF細胞培養(yǎng)物上,盲傳三代有5份標(biāo)本出現(xiàn)HCMV特征性CPE,病毒分離率為13.9%(5"36);(2) HCMV-pp65抗原血癥檢測有6份為陽性,陽性率為16.7%(6"36),與病毒分離一致率為97.2%,其中共同陽性一致率為83.3%;(3)巢式PCR法檢測結(jié)果:將36份臍血標(biāo)本中提取的DNA分別進行HCMV UL55基因巢式PCR擴增, HCMV UL55 DNA的陽性率為22.2%(7"36),與病毒分離一致率為94.4%,其中共同陽性一致率為71.4%;(4)熒光定量PCR檢測結(jié)果:將36份臍血標(biāo)本中提取的DNA分別取2μl進行熒光定量PCR擴增,根據(jù)試劑盒規(guī)定的陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),熒光定量PCR法檢測HCMV-DNA的陽性率為30.6%(11"36),與病毒分離一致率為83.3%,其中共同陽性一致率為45.5%;(5)巢式PCR擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果:巢式PCR陽性標(biāo)本測序結(jié)果與設(shè)計的序列相一致,并與基因數(shù)據(jù)庫序列比對,證明為HCMV gB2型。(6)流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞亞群變化的結(jié)果:臍血標(biāo)本中熒光定量PCR陽性組與熒光定量PCR陰性組CD_3~+淋巴細胞含量分別為(73.11±8.88)%和(71.66±8.59)%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P㧐0.05);熒光定量PCR陽性組與熒光定量PCR陰性組CD_4~+淋巴細胞含量分別為(47.52±8.53)%和(52.476±7.25)%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P㧐0.05),但熒光定量PCR陽性組CD_4~+淋巴細胞含量與熒光定量PCR陰性組相比較,有下降趨勢;熒光定量PCR陽性組與熒光定量PCR陰性組CD_8~+淋巴細胞含量分別為(25.84±4.75)%和(18.07±4.06)%,熒光定量PCR陽性組CD_8~+淋巴細胞含量高于熒光定量PCR陰性組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.01);熒光定量PCR陽性組與熒光定量PCR陰性組CD_4~+"CD_8~+比值分別為1.89±0.45和3.026±0.75,熒光定量PCR陽性組CD_4~+"CD_8~+比值低于熒光定量PCR陰性組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.01)。(7)結(jié)合新生兒臨床出生資料發(fā)現(xiàn),有一例HCMV先天性活動性感染新生兒表現(xiàn)為宮內(nèi)發(fā)育遲緩,其HCMV病毒分離、HCMV-pp65抗原血癥檢測、HCMV UL55基因巢式PCR檢測和HCMV-DNA熒光定量PCR檢測均為陽性,CD_3~+、CD_4~+、CD_8~+T淋巴細胞含量分別為66.4%、36.2%、29.5%,CD_4~+"CD_8~+比值為1.21。 結(jié)論(1)根據(jù)病毒分離結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”,初步確認(rèn)判定HCMV先天性活動性感染的指標(biāo)是:經(jīng)測序證實的PCR檢測HCMV IE、UL83基因陽性和巢式PCR檢測UL55基因陽性及HCMV-pp65抗原血癥陽性者。(2)通過對36份正常產(chǎn)婦臍血標(biāo)本進行病毒分離、HCMV-pp65抗原血癥檢測、HCMV UL55基因巢式PCR檢測和HCMV-DNA熒光定量PCR檢測,并比較,本次研究中正常產(chǎn)婦分娩的新生兒HCMV先天性感染率為30.6% ,其中,HCMV先天性活動性感染率為16.7%。(3)利用流式細胞術(shù)測定36份臍血標(biāo)本中T淋巴細胞亞群CD_3~+、CD_4~+、CD_8~+的百分比,并計算CD_4~+"CD_8~+的比值。發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR陽性組CD_4~+淋巴細胞含量與熒光定量PCR陰性組相比較,有下降趨勢;熒光定量PCR陽性組CD_8~+淋巴細胞含量高于熒光定量PCR陰性組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.01);熒光定量PCR陽性組CD_4~+"CD_8~+比值低于熒光定量PCR陰性組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.01)。并且發(fā)現(xiàn)一例HCMV先天性活動性感染的新生兒出生時體重下降。分析發(fā)現(xiàn),該新生兒的檢測結(jié)果符合先天性活動性感染的判定指標(biāo),并且有CD_8~+淋巴細胞的百分比升高,CD_4~+"CD_8~+比值下降,提示機體的細胞免疫功能降低,表明HCMV先天性活動性感染與臍血T淋巴細胞亞群即機體細胞免疫應(yīng)答狀態(tài)的改變密切相關(guān)。 (4) 36例被檢測新生兒中有一例新生兒出生時體重僅2.2千克,符合宮內(nèi)發(fā)育遲緩的診斷標(biāo)準(zhǔn)。表明迫切需要盡快建立隨訪檔案,定期對HCMV先天性活動性感染的新生兒上門體檢。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R722.1
【圖文】：

圖 1 臍血標(biāo)本病毒分離結(jié)果（未染色，×100）A：正常 HELF 細胞 B：HCMV 陽性標(biāo)本出現(xiàn) CPE3.2 HCMV pp65 抗原血癥檢測結(jié)果直接免疫熒光(FA)檢測 36 份臍血標(biāo)本中的 HCMV pp65 抗原，其中 6 份標(biāo)本為陽性，陽性率為16.7%，與病毒分離一致率為97.2%，其中共同陽性一致率為83.3%結(jié)果見圖 2。

圖２ HCMV pp65 抗原血癥檢測結(jié)果Ａ是陽性對照，在熒光顯微鏡下可見細胞核被 DAPI 染料染成均一的藍色接免疫熒光檢測可見綠色的熒光信號，Ｂ是 HCMV-pp65 抗原血癥陽性的臍血標(biāo)細胞核被 DAPI 染料染成均一的藍色，直接免疫熒光檢測可見部分細胞呈綠色信號；Ｃ是陰性對照，細胞核被 DAPI 染料染成均一的藍色，直接免疫熒光檢見綠色陽性信號。3.3 巢式 PCR 檢測結(jié)果將 36 份臍血標(biāo)本中提取的 DNA 分別進行巢式 PCR 擴增，然后分別取 6μPCR 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果見圖 3。

基因數(shù)據(jù)庫序列比對，證明為 HCMV gB2型。3.5 熒光定量 PCR 檢測結(jié)果嚴(yán)格按照試劑盒操作流程，將 36 份臍血標(biāo)本中提取的 DNA 分別取 2μl 進行熒光定量 PCR 擴增，其擴增的標(biāo)準(zhǔn)曲線及陽性動力學(xué)曲線見圖 4 和圖 5。圖 4 HCMV-DNA 熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)數(shù)

【參考文獻】

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本文編號：2766435