【摘要】： 目的 分別建立人類博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)、人類冠狀病毒229E(Human Coronavirus 229E, HCoV-229E)的實時熒光定量PCR(real-time Fluorescent Quantitative PCR, FQ-PCR)檢測方法,檢測呼吸道感染患兒標本的HBoV、HCoV-229E,并探索其臨床意義。 方法 分別根據(jù)HBoV NP1基因、HCoV-229E M基因的保守序列設計引物和Taqman探針,擴增NP1基因、M基因片段,并將其克隆到pGEMT-Easy載體上,構(gòu)建質(zhì)粒標準品;建立FQ-PCR檢測方法,建立標準曲線,進行敏感性、特異性、重復性試驗;檢測收集到的195例臨床標本中HBoV、HCoV-229E的感染情況,同時用普通PCR檢測這195例臨床標本中的HBoV、HCoV-229E;將FQ-PCR結(jié)果與普通PCR結(jié)果進行比較分析。 結(jié)果 1. FQ-PCR系統(tǒng)用于檢測HBoV NP1基因,靈敏度為101copies/μl;對臨床其他常見呼吸道病毒不出現(xiàn)特異性擴增曲線;批內(nèi)變異系數(shù)為0.13%,批間變異系數(shù)為0.14%。 2.用FQ-PCR檢測195例臨床標本,共檢出HBoV陽性12例(6.2%)。普通PCR檢測結(jié)果與FQ-PCR檢測結(jié)果一致。 3. 12例HBoV陽性標本中,患兒的年齡均為4歲以下,急性下呼吸道感染組陽性率為15.6%(10/64),顯著高于急性上呼吸道感染組的1.5%(2/131)(X2=12.45,P0.005)。 4. FQ-PCR系統(tǒng)用于檢測HCoV-229E M基因,靈敏度為101copies/μl;對臨床其他常見呼吸道病毒不出現(xiàn)特異性擴增曲線;批內(nèi)變異系數(shù)為0.4%,批間變異系數(shù)為0.7%。 5.用FQ-PCR檢測195例臨床標本,HCoV-229E陽性2例(1.0%)。普通PCR檢測結(jié)果與FQ-PCR檢測結(jié)果一致。 6.兩例HCoV-229E陽性標本均為急性下呼吸道感染的患兒。 結(jié)論 1.本研究建立的HBoV、HCoV-229E的FQ-PCR檢測方法靈敏度、特異性、重復性均較好,可用于臨床呼吸道標本的檢測以及HBoV與HCoV-229E的流行病學監(jiān)測。 2.福州地區(qū)冬春季急性下呼吸道感染患兒中,存在HBoV、HCoV-229E感染。HBoV主要引起4歲以下嬰幼兒的急性下呼吸道感染。
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R725.6
【圖文】：

M：100 bp DNA ladder ； 1：wide DNA ladder；1、2：HBoV NP1 基因陽性 PCR 產(chǎn)物 2：重組質(zhì)粒 pGEMT-Easy-NP1 酶切結(jié)果圖 1 HBoV 陽性對照擴增產(chǎn)物電泳圖 圖 2 重組質(zhì)粒 pGEMT-Easy-NP1 酶切電圖 3 重組質(zhì)粒 pGEMT-Easy-NP1 的部分序列圖三、重組質(zhì)粒的定量重組質(zhì)粒的濃度（拷貝/μl）計算。將提取的重組質(zhì)粒 DNA，用 GeneQuant Pro 儀測定，重組質(zhì)粒pGEMT-Easy-NP1 的濃度為 72.6μg/ml。通過下述公式將重組質(zhì)粒濃度單μg/ml 轉(zhuǎn)換成 copies/μl，72.6μg/ml 經(jīng)換算后為 2.17×1010copies/μl。

M：100 bp DNA ladder ； 1：wide DNA ladder；1、2：HBoV NP1 基因陽性 PCR 產(chǎn)物 2：重組質(zhì)粒 pGEMT-Easy-NP1 酶切結(jié)果圖 1 HBoV 陽性對照擴增產(chǎn)物電泳圖 圖 2 重組質(zhì)粒 pGEMT-Easy-NP1 酶切電圖 3 重組質(zhì)粒 pGEMT-Easy-NP1 的部分序列圖三、重組質(zhì)粒的定量重組質(zhì)粒的濃度（拷貝/μl）計算。將提取的重組質(zhì)粒 DNA，用 GeneQuant Pro 儀測定，重組質(zhì)粒pGEMT-Easy-NP1 的濃度為 72.6μg/ml。通過下述公式將重組質(zhì)粒濃度單μg/ml 轉(zhuǎn)換成 copies/μl，72.6μg/ml 經(jīng)換算后為 2.17×1010copies/μl。

圖 3 重組質(zhì)粒 pGEMT-Easy-NP1 的部分序列圖三、重組質(zhì)粒的定量重組質(zhì)粒的濃度（拷貝/μl）計算。將提取的重組質(zhì)粒 DNA，用 GeneQuant Pro 儀測定，重組質(zhì)粒pGEMT-Easy-NP1 的濃度為 72.6μg/ml。通過下述公式將重組質(zhì)粒濃度單位由μg/ml 轉(zhuǎn)換成 copies/μl，72.6μg/ml 經(jīng)換算后為 2.17×1010copies/μl。質(zhì)粒 DNA 濃度＝ 質(zhì)粒 DNA 濃度（μg/ml）× 6.2×1023(copies/μl) 660g/mol×堿基對數(shù)四、標準曲線重組質(zhì)粒pGEMT-Easy-NP1依次稀釋成107、106、105、104copies/μl濃度梯度，在ABI7300擴增儀上進行擴增，得到標準曲線Y= 3.50X+34.02（其中Y對應Ct值，X為標本拷貝數(shù)，圖4）。

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本文編號：2760363