【摘要】： 目的 神經(jīng)管畸形(neural tube defects,NTD)是人類常見先天畸形,是影響人口素質(zhì)的最常見、最嚴(yán)重的出生缺陷性疾病之一。它是由于在胚胎發(fā)育過程中,神經(jīng)管閉合不全所引起的一組缺陷,包括無腦畸形、腦膨出和脊柱裂等。它們在病因?qū)W上是多因素的,是遺傳學(xué)因素和環(huán)境因素共同作用結(jié)果。胚胎腦發(fā)育的早期階段主要是神經(jīng)板隆起、彎曲、閉合形成神經(jīng)管,神經(jīng)管的頭部從前向后依次發(fā)育形成腦的基本組織形態(tài),即端腦、間腦、中腦、后腦,在神經(jīng)管閉合過程中出現(xiàn)異常就會導(dǎo)致NTD。 發(fā)育生物學(xué)研究表明,細(xì)胞凋亡現(xiàn)象在發(fā)育過程中普遍存在,對于多細(xì)胞生物的組織和形體構(gòu)建具有重要作用。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖與分化相同,都是胚胎發(fā)育過程中的一部分,是由一系列相關(guān)基因所控制。胚胎發(fā)生過程中凋亡即細(xì)胞死亡,這對于整體構(gòu)型布局與組織形成是極為重要的。過多或過少的凋亡都能干擾整個機(jī)體和器官的正常發(fā)育及形態(tài)形成。Caspase-3是一種活化的參與細(xì)胞程序性死亡的蛋白酶。Caspase-3基因敲出鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)管畸形表型,這部分原因歸咎于神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞凋亡功能的喪失。 許多資料顯示NTD與細(xì)胞凋亡有關(guān),目前,有多種通路可以解釋凋亡的發(fā)生機(jī)制,其中caspase蛋白酶家族在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路中起關(guān)鍵作用。該通路通過激活caspase-4,caspase-7,caspase-8,caspase-3,caspase-6多個成員的級聯(lián)反應(yīng),最終引起細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn),caspase-3基因敲出的小鼠易早死,因其腦中皮層、小腦、紋狀體、海馬各區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)了異常增殖,表明caspase-3在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起著重要的作用。 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一。目前已發(fā)現(xiàn)存在著多條并行的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,不同的細(xì)胞外刺激可以激活不同的MAPK信號通路,許多生長因子、細(xì)胞因子、G蛋白偶聯(lián)受體、應(yīng)激信號及有絲分裂原等均可激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡中起著關(guān)鍵作用。在哺乳動物5種不同的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase,JNK)和P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。 因此,本研究以胚胎12、15、17和20天神經(jīng)管畸形大鼠為研究對象,采用HE染色法、免疫組織熒光染色法、Western-blot法觀察胚胎12天、15天、17天和20天神經(jīng)管畸形大鼠神經(jīng)組織細(xì)胞caspase-3表達(dá)和分布,并進(jìn)一步對caspase-3表達(dá)和MAPK家族JNK蛋白磷酸化的關(guān)系進(jìn)行了初步探討。對于深入探討神經(jīng)管畸形的病理演變規(guī)律具有重要意義。 方法 一、神經(jīng)管畸形大鼠模型制作與動物分組 1、維甲酸溶于橄欖油中(40mg/ml),以劑量為135mg/kg給藥,經(jīng)胃管注入孕10天Wister大鼠制作神經(jīng)管畸形大鼠模型,給等量橄欖油為對照組。 2、實驗分組:對照組和脊柱裂組按照孕12天、15天、17天和20天分為4個亞組。 二、脊柱裂畸形組胎鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡情況分析以及細(xì)胞凋亡信號通路中caspase-3與MAPK家族JNK的關(guān)系 1、應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測caspase-3在對照組、畸形組胎鼠脊髓組織細(xì)胞中的分布和表達(dá)。 2、應(yīng)用Western blot方法檢測畸形組與對照組胎鼠脊髓組織MAPK家族中JNK磷酸化情況。 結(jié)果 一、神經(jīng)管畸形大鼠模型 在大鼠孕10天給予維甲酸(135mg/kg體重),孕12天、15天、17天、20天剖腹取出胎鼠可發(fā)現(xiàn)腦膨出、脊柱裂、無尾、肛門閉鎖等多種畸形。 二、大鼠胚胎12天、15天、17天、20天對照組和脊柱裂畸形組脊髓神經(jīng)組織caspase-3表達(dá)情況分析 用免疫熒光染色方法可發(fā)現(xiàn)胚胎15天、17天和20天顯性脊柱裂畸形鼠脊髓組織caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)多于對照組,熒光強(qiáng)度高于對照組。胚胎15天、17天、20天顯性脊柱裂畸形鼠脊髓組織caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于胚胎12天顯性脊柱裂畸形組。 三、大鼠胚胎12天、15天、17天、20天對照組和脊柱裂畸形組脊髓神經(jīng)組織中MAPK家族JNK磷酸化情況 用Western-blot方法檢測不同組胎鼠脊髓神經(jīng)組織中MAPK家族JNK磷酸化水平,結(jié)果表明胚胎12天、15天、17天和20天脊柱裂畸形鼠脊髓神經(jīng)組織JNK磷酸化水平高于對照組。脊柱裂畸形鼠胚胎15天脊髓神經(jīng)組織JNK磷酸化水平達(dá)到峰值。 結(jié)論 1、胚胎12、15、17、20天顯性脊柱裂胎鼠脊髓組織caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)目從胚胎15天開始明顯增多,提示細(xì)胞進(jìn)入凋亡高峰階段。 2、顯性脊柱裂胎鼠脊髓神經(jīng)組織細(xì)胞MAPK家族JNK磷酸化在胚胎15天達(dá)到峰值,同時顯性脊柱裂胎鼠脊髓組織caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)目從胚胎15天開始明顯增多,提示凋亡蛋白caspase-3表達(dá)增多與MAPK家族JNK信號通路相關(guān),說明異常細(xì)胞凋亡參與了維甲酸誘導(dǎo)顯性脊柱裂胎鼠形成過程,并且此異常的細(xì)胞凋亡可能與MAPK家族JNK細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R726.8
【圖文】：

胎鼠出現(xiàn)死胎、吸收胎、顯性脊柱裂等畸形，其他還可見腦膨出、肛門直腸畸形、無尾畸形、環(huán)尾、短尾、臍膨出、唇鄂裂、足畸形等。神經(jīng)管畸形發(fā)生率是42%。詳細(xì)結(jié)果見表1及圖1。表1，孕第IOd給維甲酸在孕不同時間取出胎鼠顯性脊柱裂發(fā)生率的比較組別胎鼠數(shù)活胎數(shù)死胎、吸收顯性脊柱致死顯性脊柱裂孕天數(shù)(只)(只)胎數(shù)(只)裂(只)率(%)形率(%) 12d55505239.041.8l5l642.9，4J勺‘

本文編號：2756727