【摘要】： 研究背景:新生兒窒息致缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage ,HIBD)是新生兒期常見的臨床疾病,已成為導致兒童腦癱、嚴重危害新生兒健康成長的重要原因。2003年我國進行第二次多中心治療觀察重度HIBD的預后,發(fā)現(xiàn)預后不良率仍高達20.8%,因此目前的治療手段對中重度HIBD的療效仍然很有限。近年對干細胞的研究表明,新生動物腦內(nèi)存在神經(jīng)干細胞(neural stem cells ,NSC),在HIBD后,內(nèi)源性NSC可反應性增殖、分化以促進腦結(jié)構(gòu)及功能的改善。但內(nèi)源性NSC反應性增殖、分化的力度很有限,其分化率較低。Liu等采用5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)標記技術(shù)追蹤觀察HIBD后海馬齒狀回新生NSC分化為神經(jīng)元的情況,發(fā)現(xiàn)在HIBD后15天,未見NSC分化為成熟神經(jīng)元,在26天后也僅有27%的BrdU陽性細胞分化為成熟神經(jīng)元。Masanori等追蹤觀察HIBD后沙鼠室管膜下區(qū)及顆粒層NSC增殖及分化情況,表明在HIBD后10天室管膜下區(qū)NSC增加了3倍,追蹤觀察到60天也僅有少數(shù)細胞分化為表達神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein ,GFAP,成熟星型膠質(zhì)細胞表面標志)的星型膠質(zhì)細胞和表達神經(jīng)元特異性核抗原(neuron-specific nuclear antigen,NeuN,成熟神經(jīng)元表面標志)的神經(jīng)元。因此,如何提高內(nèi)源性神經(jīng)干細胞在腦內(nèi)的增殖和神經(jīng)性分化效率,真正發(fā)揮干細胞的替代修復作用值得深入研究。近年來研究表明,干細胞在腦內(nèi)的分化受局部微環(huán)境影響。因此,在HIBD后的病態(tài)微環(huán)境中是否存在某種因素抑制了內(nèi)源性神經(jīng)干細胞再生和神經(jīng)性分化,從而導致內(nèi)源性NSC的分化率較低,難以有效的重建大腦結(jié)構(gòu)及功能值得深入研究。如能找到這一抑制性因素并采取針對性治療措施,將有望全面改善HIBD預后。 Foxg1基因是FOX基因家族的一個重要成員,研究表明胚胎大腦發(fā)育過程中干細胞的增殖、分化受到關(guān)鍵基因Foxg1的調(diào)控,該基因的表達缺陷將導致干細胞發(fā)育分化障礙,進一步導致大腦結(jié)構(gòu)發(fā)育缺陷,且正常出生后Foxg1仍然持續(xù)表達于由端腦分化來的腦組織(大腦皮質(zhì)、海馬、嗅球及基底核等)中,而發(fā)生HIBD時正是這些腦組織容易受到損傷。新生動物HIBD后腦結(jié)構(gòu)與功能重建是胚胎期發(fā)育的再現(xiàn)和延續(xù),因而Foxg1基因可能在HIBD后干細胞分化增殖的過程中扮演一重要角色因素。 目的:觀測HIBD后Foxg1基因和腦皮質(zhì)各層特定基因(Foxp2, ER81, Otx1, Foxp1, ROR?)表達的動態(tài)變化分析兩者的相關(guān)性,初步探討是否存在HIBD后Foxg1基因水平的下降導致大腦皮質(zhì)自身修復受限,表現(xiàn)為各層結(jié)構(gòu)特定基因表達下調(diào);觀測卡哈爾—雷濟厄斯細胞(Cajal-Retzius cells,CR細胞)在發(fā)生HIBD后的變化情況,初步探討是否存在內(nèi)源性NSC向CR細胞分化增多,而向其它皮質(zhì)層的成熟神經(jīng)細胞分化減少的現(xiàn)象。 方法:采用Rice法制作新生鼠HIBD動物模型,假手術(shù)組作為對照組,分別在術(shù)后第3、7、14、28、56天取右側(cè)腦半球。半定量RT-PCR檢測標本中各個基因的表達,免疫組化檢測標本CR細胞數(shù)目變化。 結(jié)果: 1模型鑒定:常規(guī)HE染色檢查結(jié)果顯示結(jié)扎側(cè)出現(xiàn)明顯的病理變化,病變在大腦皮層和海馬尤為明顯,主要為神經(jīng)元壞死,表現(xiàn)為空泡、核固縮、組織結(jié)構(gòu)模糊及炎癥細胞增多等。 2半定量RT-PCR結(jié)果:(1)Foxg1基因:Foxg1基因的表達在術(shù)后第3、7、14、28、56天的結(jié)果分別為0.524±0.086,0.726±0.067,0.770±0.122 , 0.786±0.083 , 0.882±0.081 ;對照組的結(jié)果分別為0.798±0.121,0.787±0.078,0.664±0.109,0.744±0.096,0.757±0.065。兩組比較在第3天和第56天有顯著性差異�？傮w上模型組Foxg1基因的表達在早期出現(xiàn)明顯下調(diào)隨著時間的推移呈現(xiàn)出上升趨勢而對照組Foxg1基因表達相對較穩(wěn)定。(2)Reelin基因:Reelin基因的表達在術(shù)后第3、7、14、28、56天的結(jié)果分別為0.591±0.034,0.542±0.131,0.533±0.085 , 0.694±0.063 , 0.668±0.144 ;對照組的結(jié)果分別為0.565±0.113,0.329±0.062,0.474±0.081,0.553±0.073,0.618±0.104。兩者比較在第7天和第28天有顯著性差異�？傮w上模型組Reelin基因的表達量在各個時間點均高于對照組。(3)Foxp1基因:Foxp1基因的表達在術(shù)后第3、7、14、28、56天的結(jié)果分別為0.616±0.056,0.886±0.096,0.710±0.059,0.636±0.070,0.698±0.109;對照組的結(jié)果分別為0.737±0.115 , 0.743±0.102 , 0.746±0.108 , 0.735±0.082 ,0.899±0.064。兩者比較在第3、7、28和56天有顯著性差異�？傮w上模型組Foxp1基因的表達水平是低于對照術(shù)組。(4)ER81基因:ER81基因的表達在術(shù)后第3、7、14、28、56天的結(jié)果分別為0.654±0.096,0.942±0.068,0.724±0.094,0.838±0.105,0.977±0.123;對照組的結(jié)果分別為0.710±0.120 , 0.666±0.139 , 0.797±0.107 , 0.941±0.141 ,1.027±0.113。兩者比較在第7天有顯著性差異�？傮w上模型組基因的表達水平低于對照組。(5)Otx-1基因:術(shù)后第3天模型組Otx-1基因的表達未能檢測出而對照組正常測出。從術(shù)后第7天開始模型組和對照組均能夠檢測出,且在第7天后模型組Otx-1的表達水平高于對照組。模型組的表達在術(shù)后第3、7、14、28、56天的結(jié)果分別為0.000±0.000,0.713±0.122,0.570±0.134,0.535±0.037,0.551±0.044;對照組的結(jié)果分別為0.571±0.098 , 0.466±0.137 , 0.463±0.133 , 0.462±0.121 ,0.401±0.061。兩者比較在第7天和第56天有顯著性差異。(6)RORβ基因:RORβ基因的表達在術(shù)后第3、7、14、28、56天的結(jié)果分別為00.951±0.118,0.839±0.078,0.786±0.114,0.828±0.109,1.120±0.204;對照組的結(jié)果分別為0.984±0.133,0.868±0.169,1.060±0.225,1.238±0.155,0.854±0.094。兩者比較在第14、28和56天有顯著性差異�？傮w上在發(fā)生HIBD后的前期RORβ基因的表達是降低的。(7)Foxp2基因:Foxp2基因的表達在術(shù)后第3、7、14、28、56天的結(jié)果分別為0.460±0.107 , 0.526±0.119 , 0.566±0.164 , 0.455±0.050 ,0.570±0.061 ;對照組的結(jié)果分別為0.543±0.104 , 0.420±0.163 ,0.452±0.055,0.469±0.043,0.422±0.055。兩者比較在第14天和第56天有顯著性差異�？傮w上在發(fā)生HIBD后的前期Foxp2基因的表達是降低的。 3免疫組織化學結(jié)果:在進行免疫組化染色之后結(jié)果顯示模型組隨著時間的推移Reelin抗原陽性細胞(主要為CR細胞)增生明顯,而對照組細胞數(shù)目變化不大。鏡下顯示增生的陽性細胞分布不均且有團狀聚集傾向。模型組在第3、7、14、28、56天的陽性細胞數(shù)分別為24.9±2.424,31.4±4.452,42.3±2.908,47.1±1.853,45.5±2.173個;對照組陽性細胞數(shù)分別為21.7±2.627,21.7±3.199,21.8±3.190,22.4±2.221,27±2.000個。兩者在各個時間點比較,差異均有顯著性意義(P 0.05 )。 4統(tǒng)計學結(jié)果 正常情況下即對照組中Otx1基因與Foxg1基因的表達呈正相關(guān)而模型組Otx1基因與Foxg1基因的表達卻變成了負相關(guān),Reelin基因與Foxg1基因的表達在對照組中呈現(xiàn)負相關(guān)而模型組中卻變成了正相關(guān),Foxp1、ER81、RORβ、Foxp2基因與Foxg1基因的關(guān)系在對照組和模型組中均呈現(xiàn)出負相關(guān)性。 結(jié)論: HIBD后新生鼠腦組織中Foxg1基因表達下調(diào),皮質(zhì)特定基因Reelin基因表達上調(diào),Foxp2, ER81, Otx1, Foxp1和ROR?基因表達下調(diào)。由于HIBD后早期腦組織Foxg1基因的表達下調(diào)導致內(nèi)源性NSC向CR細胞分化增加而向各層腦皮質(zhì)的成熟神經(jīng)元分化減少,導致HIBD早期腦組織自身修復困難。發(fā)生HIBD后Foxg1基因的表達與Reelin,Otx-1基因的表達關(guān)系密切,Reelin基因的表達與Foxg1基因呈正相關(guān),Otx-1基因的表達與Foxg1基因呈負相關(guān)。Foxg1基因與Foxp1,ER81,RORβ,Foxp2基因表達的關(guān)系不明顯。Foxg1基因是否作為腦皮質(zhì)特定基因的上游基因直接控制這些基因的表達有待進一步的研究。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R722.1
【圖文】：

瓊脂糖凝膠電泳

38×40 倍光學顯微鏡 ×200 倍光學顯微鏡圖 10： A、B、C、D 是 DAB 顯色（A 和 B 是模型組 C 和 D 是對照組），E 和 F 是空白對照。圖 B 中“ ”箭頭所指為 Reelin 陽性細胞。

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本文編號：2756693