【摘要】： 先天性心臟病(Congential heart disease,CHD)是常見的新生兒先天性畸形,近年來先心病發(fā)病呈上升趨勢。約90%的先心病屬于多基因病,多基因病的遺傳因子和環(huán)境因子的性質(zhì)相當(dāng)復(fù)雜。某些高發(fā)家系僅僅是由單個基因座位與個別環(huán)境因子相互作用所致,而大多數(shù)散發(fā)型先心病是由多個基因座位的微小效應(yīng)疊加在一起相互作用引起的,散發(fā)型非高發(fā)家系的先心病患者又占多基因遺傳的90%以上,因此對散發(fā)型先心病發(fā)病機(jī)制研究更為重要。目前先心病的研究主要集中于從部分基因座位著手揭示多基因的分子病理機(jī)制。模式生物研究證實心臟轉(zhuǎn)錄因子功能異�？蓪�(dǎo)致嚴(yán)重的先心病,其基因突變成為目前先天性心臟病發(fā)病機(jī)制研究的焦點。多基因疾病發(fā)生過程中參與的遺傳因素存在明顯的地區(qū)差異和種族差異。最早發(fā)現(xiàn)的心臟特異性同源盒轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5(Homobox transcription factor,NKX2.5)基因國外人群共發(fā)現(xiàn)29種突變,突變率約4%。國內(nèi)人群Li Tian在一個房間隔缺損家系中發(fā)現(xiàn)NKX2.5基因3個錯義突變,而散發(fā)型先心病中至今僅孫淼發(fā)現(xiàn)了一個三堿基的缺失。國外人群研究GATA4基因突變率僅為約2%,而中國漢族人群唐朝暉在31例患者中卻發(fā)現(xiàn)了兩個新的錯義突變Val267Met、Val380Met。提示中國漢族人群先天性心臟病患者轉(zhuǎn)錄因子基因突變檢測率及突變位點可能與國外人群不同。CITED2基因(cAMP-responsive element-binding protein,CBP/p300)cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因是轉(zhuǎn)錄激活因子家族中新發(fā)現(xiàn)的成員之一,目前發(fā)現(xiàn)的3種突變均集中于編碼鏈的絲氨酸-甘氨酸富含區(qū)(serine-glycine-rich junction SGJ)序列。本課題擬研究散發(fā)型先心病患者與瓣膜缺損相關(guān)的NKX2.5、GATA4、CITED2基因,了解中國漢族人群中的先心病突變位點及分布情況,并進(jìn)一步分析基因型與表型間的關(guān)系。 先心病由環(huán)境因素和遺傳因素相互作用引起,即遺傳易感性和環(huán)境致畸原的相互作用是先心病的發(fā)病原因。既往研究認(rèn)為孕期母親暴露于先心病高危因素會增加子代先心病風(fēng)險,所以本研究還回顧性探討孕期父母暴露因素與葉酸補(bǔ)充情況,了解葉酸補(bǔ)充與孕母自身葉酸代謝酶5,10亞甲基四氫葉酸還原酶基因(methylenetrahydrofolate reduclase gene,MTHFR)C677T基因型之間的交互作用,并比較病例組父代及對照組父代突變等位基因頻率,分析其對子代發(fā)病的風(fēng)險。 第一部分散發(fā)型先天性心臟病NKX2.5、GATA4、CITED2基因突變檢測 第一節(jié)NKX2.5基因在散發(fā)型先天性心臟病中的突變檢測 目的:研究中國人群散發(fā)型先天性心臟病NKX2.5基因編碼鏈突變。 方法:收集135個散發(fā)型先天性心臟病患者和114例正常健康新生兒血液進(jìn)行DNA抽提、PCR擴(kuò)增NKX2.5基因的編碼鏈,應(yīng)用變性高效液相色譜儀(Denaturing high performance liquid chro matography DHPLC)檢測并DNA測序驗證突變。 結(jié)果:在室間隔缺損病人中發(fā)現(xiàn)一種新的錯義突變,編碼鏈第848位堿基C轉(zhuǎn)換為A,導(dǎo)致283位密碼子由CCG轉(zhuǎn)換為CAG,編碼的氨基酸由脯氨酸轉(zhuǎn)換為谷胺酰胺(p.Pro283Gln),這種突變對照組未檢測到。發(fā)現(xiàn)兩種已報道單核苷酸多態(tài)性rs2277923和rs3729753,分別導(dǎo)致第21位密碼子GAG轉(zhuǎn)變?yōu)镚AA和第303位密碼子CTG轉(zhuǎn)變?yōu)镃TC,均為同義突變�；蛐皖l率及等位基因頻率與以往報道相同,兩組沒有差異。既往報道的33種突變位點本研究中未檢測到。 結(jié)論:NKX2.5基因Pro283Gln突變位點可能是室間隔缺損患者的發(fā)病原因之一。 第二節(jié)GATA4基因在散發(fā)型先天性心臟病中的突變檢測 目的:檢測中國漢族人群散發(fā)型先天性心臟病患者GATA4基因編碼鏈突變。 方法:應(yīng)用PCR—DHPLC對135例散發(fā)型先天性心臟病患者和114例健康對照組進(jìn)行GATA4基因編碼序列的突變檢測,對異常峰型PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序驗證。 結(jié)果:發(fā)現(xiàn)兩個新的錯義突變和三個新的單核苷酸多態(tài)性位點。錯義突變分別是在散發(fā)型VSD患者中發(fā)現(xiàn)的位于exonl的Pro163Ser,和散發(fā)型TOF患者位于exon6的Pro407Gln,對照組中均未檢測到。位于編碼鏈的新的核苷酸多態(tài)性位點Ala33Ala系同義突變。內(nèi)含子區(qū)域檢測到兩個SNP改變。比較SNP基因型頻率及等位基因頻率病例組及對照組均沒有顯著性差異。 結(jié)論:GATA4基因錯義突變可能是中國人群室間隔缺損和法洛氏四聯(lián)癥的發(fā)病原因之一。GATA4基因突變可能多存在于中國散發(fā)型先心病患者而且對應(yīng)先心病表型呈多樣化。 第三節(jié)GITED2基因在散發(fā)型先天性心臟病中的突變檢測 目的分析先天性心臟病(congenital heart defects,CHD)患者的CITED2基因編碼鏈基因突變的情況。 方法收集101例散發(fā)型CHD患者和104例正常健康新生兒血液進(jìn)行DNA抽提、PCR擴(kuò)增,應(yīng)用DHPLC進(jìn)行CITED2基因全部編碼序列的突變檢測,對有異常峰型的DNA進(jìn)行直接測序,并與GeneBank進(jìn)行比較。 結(jié)果首次在動脈導(dǎo)管未閉的患者發(fā)現(xiàn)CITED2基因的一種新的插入突變,在CITED2基因編碼鏈堿基483位起始處插入一個重復(fù)9肽(c483_484ins27),導(dǎo)致蛋白的絲氨酸—甘氨酸富含區(qū)(SGJ)插入9個氨基酸p.Ser161-Gly162ins9。對照組中未檢測到此突變。在CITED2基因的EP300結(jié)合基序未發(fā)現(xiàn)突變。 結(jié)論中國先心病患者中存在CITED2基因突變,新發(fā)現(xiàn)的CITED2基因的重復(fù)9肽插入突變c483_484ins27可能是導(dǎo)致動脈導(dǎo)管未閉發(fā)生的原因之一。 第二部分先心病患者父代NKX2.5、GATA4、CITED2基因突變檢測 目的研究患者父代NKX2.5、GATA4、CITED2基因編碼鏈的突變情況,了解患者父代基因突變或SNP對子代先心病發(fā)病風(fēng)險的影響。 方法收集137例散發(fā)型CHD患者父親或母親和114例正常健康對照組父母血液進(jìn)行DNA抽提、PCR擴(kuò)增,應(yīng)用DHPLC檢測NKX2.5、GATA4、CITED2基因全部編碼鏈的突變情況。對有異常峰型的DNA進(jìn)行直接測序。 結(jié)果在法洛氏四聯(lián)癥患者(33)無先心病的父親血液基因組中發(fā)現(xiàn)與患者相同的Pro163Ser突變。6個SNP位點患者父代中均存在,NKX2.5基因rs2277923多態(tài)性位點父代與子代基因型組合發(fā)現(xiàn)父代雜合型/子代野生型及父代野生型/子代雜合型較父代野生型/子代野生型后代有更大風(fēng)險獲得先天性心臟病(P＜0.05) 結(jié)論患者未患先心病的一級親屬中也可以存在GATA4基因Pro163Ser基因突變位點。 第三部分孕期環(huán)境高危因素與MTHFR基因C677T多態(tài)性對子代先心病發(fā)病風(fēng)險研究 目的分析孕母孕早期環(huán)境高危因素,探討葉酸攝入與MTHFR基因多態(tài)性間交互作用對先心病發(fā)病的影響。 方法通過病例對照研究回顧性分析98例先心病患者母親和101例正常對照組母親孕期危險因素暴露水平,及葉酸及復(fù)合維生素攝入情況,并進(jìn)一步應(yīng)用DHPLC檢測MTHFRC677T多態(tài)性了解與葉酸攝入的交互作用。 結(jié)果Logistic回歸分析有6項因素納入先心病風(fēng)險模型,孕母教育程度、沒有定期產(chǎn)檢、精神緊張、接觸化學(xué)物質(zhì)是子代先心病的高危因素,服用葉酸和復(fù)合維生素是先心病的保護(hù)因素。三種基因型對照組攝入葉酸情況均與病例組有顯著差異(P＜0.05)。每天服用葉酸情況下,MTHFR基因各基因型比較病例組與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。僅間斷服用葉酸組較未服用葉酸組各基因型比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,合并有時服用及未服用葉酸比較孕母基因型為CT與CC時發(fā)病相對風(fēng)險,P值為0.087,OR值為2.018(0.95-4.285)。 結(jié)論提高孕母的自我保健意識是減少先心病危險因素暴露的重要措施。懷孕早期孕母葉酸的補(bǔ)充不足可能是導(dǎo)致子代先心病發(fā)病風(fēng)險增高的獨(dú)立因素,孕母MTHFR基因C677T基因型合并葉酸補(bǔ)充不足可能增加先心病風(fēng)險。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R725.4
【圖文】：

51一mutatinn表示刃尤粉.萬基因外顯子1突變引起的異常峰型，sl一wide表示對照的正常峰型。上方測序圖sl一P一antisense為反向序列，突變位置為箭頭所指C一T，表示引起刀尤粉.萬外顯子單核普酸多態(tài)性rs2277923(e一63G>A)。但氨基酸未改變(p.GluZIGlu);52和53對應(yīng)exonZ的兩個擴(kuò)增片段，52一mutatlon及53一mutatinn表示入誘腸夕.萬基因外顯子2的異常峰型。52一Wide及53一wide表示正常峰型。上方測序圖P一sense為突變基因正向序列，突變位置為箭頭所指部位堿基，52所指C一G(e一6o6e>G)，屬己知s即rs3729753，為同義突變氨基酸未改變(p.Leu303Leu)。53突變位置為箭頭所指C一A(。一848C>A)，屬新發(fā)現(xiàn)錯義突變，導(dǎo)致氨基酸改變。

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 許忠民;甘藍(lán)CMS451不育系的選育和利用及其不育機(jī)理研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 郝玉娟;圍產(chǎn)兒出生缺陷相關(guān)因素分析[D];鄭州大學(xué);2013年

2 趙鶴;漢族散發(fā)法洛四聯(lián)癥患兒GATA6、TBX20基因的表達(dá)研究[D];首都醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號：2756075