【摘要】：第一部分:免疫性冠狀動(dòng)脈炎小鼠血漿炎癥因子及血液?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞中miRNA-199b-5p的動(dòng)態(tài)變化目的:觀察免疫性冠狀動(dòng)脈炎小鼠血漿炎癥因子及血單個(gè)核細(xì)胞中miRNA-199b-5p的動(dòng)態(tài)變化,預(yù)測(cè)相關(guān)靶基因,為研究免疫性冠狀動(dòng)脈炎的發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)。方法:1.分別連續(xù)5天給予C57BL/6小鼠腹腔注射白色念珠菌水溶物(8mg/只)或磷酸鹽緩沖液(0.1ml/只)。注射后不同時(shí)間點(diǎn)(24h、3d、7d、14d、28d)處死小鼠,采血,留取心臟及冠狀動(dòng)脈標(biāo)本,檢測(cè)血常規(guī)、制備心臟病理切片,確定小鼠免疫性冠狀動(dòng)脈炎模型制作成功。2.分離小鼠血漿標(biāo)本,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法測(cè)定血漿中IL-6、TNF-α水平。Trizol法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞中總RNA,采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定其中IL-6、TNF-αmRNA及miRNA-199b-5p水平。3.利用PITA、Target Scan和micro RNAorg數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行miRNA-199b-5p靶基因預(yù)測(cè),DAVID生物信息學(xué)軟件對(duì)共同靶基因行GO和KEGG分析,獲取與免疫性血管炎相關(guān)的靶基因。結(jié)果:1.小鼠免疫性冠狀動(dòng)脈炎模型成功建立。2.實(shí)驗(yàn)組小鼠血漿IL-6、TNF-α水平,在注射后3d、7d時(shí)升高(P均0.05)。單個(gè)核細(xì)胞中IL-6、TNF-αmRNA水平在注射后3d、7d時(shí)升高(P均0.05),miRNA-199b-5p水平在注射后24h、3d、7d、14d時(shí)降低(P均0.05)。3.數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)獲得共有90個(gè)共同的靶基因,其中與免疫性血管炎有關(guān)的為NFKB。結(jié)論:1.連續(xù)5天腹腔注射白色念珠菌水溶物8mg/只,是構(gòu)建免疫性冠狀動(dòng)脈炎小鼠模型的合適方法。2.IL-6、TNF-α是參與了免疫性冠狀動(dòng)脈炎的炎癥因子。3.miRNA-199b-5p可能通過(guò)調(diào)控NF-κB靶基因表達(dá),參與冠狀動(dòng)脈炎癥的病理過(guò)程。第二部分:免疫性冠狀動(dòng)脈炎小鼠血液?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞中miRNA-199b-5p表達(dá)與NF-κB及其信號(hào)通路相關(guān)性研究目的:分析miRNA-199b-5p和NF-κB在冠狀動(dòng)脈炎小鼠中的表達(dá)及其意義,探討miRNA-199b-5p與NF-κB在免疫性冠狀動(dòng)脈炎中的作用及二者之間的關(guān)系。方法:實(shí)驗(yàn)組C57BL/6小鼠腹腔注射CAWS制作免疫性冠狀動(dòng)脈炎動(dòng)物模型,對(duì)照組小鼠腹腔內(nèi)注射等體積PBS。分別于注射后24h、3d、7d、14d及28d采集血液,留取其心臟標(biāo)本。檢測(cè):1.RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)兩組小鼠不同日齡血液?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞中miRNA-199b-5p表達(dá)量及NF-κB的mRNA表達(dá)水平。2.EVG染色檢測(cè)小鼠血管彈力纖維改變情況。免疫組織化學(xué)測(cè)定NF-κB在血管內(nèi)皮細(xì)胞中分布情況的變化。3.Western blot法檢測(cè)血液?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)水平。比較不同日齡免疫性冠狀動(dòng)脈炎小鼠及對(duì)照組間miRNA-199b-5p與NF-κB表達(dá)差異,分析二者變化的相關(guān)性。結(jié)果:1.急性期(3d、7d)實(shí)驗(yàn)組小鼠單個(gè)核細(xì)胞中NF-κB的mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(p0.05),亞急性期(14d、28d)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.小鼠心臟EVG染色顯示亞急性期(14d)出現(xiàn)血管彈力纖維破壞。實(shí)驗(yàn)組(24h、3d、7d、14d)小鼠免疫組織化學(xué)染色顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞核NF-κB-p65水平明顯高于對(duì)照組(p0.05);實(shí)驗(yàn)組(3d、7d、14d)小鼠血液?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞Western Blot顯示NF-κB水平明顯高于對(duì)照組(p0.05),28d組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3.實(shí)驗(yàn)組小鼠血液?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞中miRNA-199b-5p表達(dá)量與NF-κB水平呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論:1.冠狀動(dòng)脈炎小鼠血液?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在NF-κB表達(dá)的上調(diào)。2.miRNA-199b-5p可能通過(guò)改變靶基因NF-κB的表達(dá),調(diào)控小鼠免疫性血管炎的炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R725.4
【圖文】：

程后期14、28d時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠體重均漸恢復(fù)，與對(duì)照組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組小鼠注射結(jié)束后24h及3d時(shí)體質(zhì)量降低變化，7d時(shí)的心臟質(zhì)量降低變化，與對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果如下圖1-1（table1、2）：圖1-1圖1-1注：Table1：顯示小鼠體質(zhì)量比較:**: P<0.01，*: P<0.05，左側(cè)條為對(duì)照組，右側(cè)條為實(shí)驗(yàn)組。Table2：顯示小鼠心臟質(zhì)量比較:*: P<0.05，左側(cè)條為對(duì)照組，右側(cè)條為實(shí)驗(yàn)組。1.2 冠狀動(dòng)脈炎小鼠血常規(guī)改變實(shí)驗(yàn)組小鼠白細(xì)胞及血小板均值均高于對(duì)照組。白細(xì)胞及血小板值在兩組間差異在注射刺激物后24h、3d、7d有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果如下圖1-2（table3、4）：圖1-2圖1-2注：Table3：小鼠血常規(guī)白細(xì)胞值:**: P<0.01，*: P<0.05，左側(cè)條為對(duì)照組，右側(cè)條為實(shí)驗(yàn)組。Table4：小鼠血常規(guī)血小板值:*: P<0.05，左側(cè)條為對(duì)照組，右側(cè)條為實(shí)驗(yàn)組。1.3 小鼠冠狀動(dòng)脈組織病理學(xué)改變1.3.1 HE 染色。對(duì)照組：血管內(nèi)皮完整光滑

1.2 冠狀動(dòng)脈炎小鼠血常規(guī)改變實(shí)驗(yàn)組小鼠白細(xì)胞及血小板均值均高于對(duì)照組。白細(xì)胞及血小板值在兩組間差異在注射刺激物后24h、3d、7d有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果如下圖1-2（table3、4）：圖1-2圖1-2注：Table3：小鼠血常規(guī)白細(xì)胞值:**: P<0.01，*: P<0.05，左側(cè)條為對(duì)照組，右側(cè)條為實(shí)驗(yàn)組。Table4：小鼠血常規(guī)血小板值:*: P<0.05，左側(cè)條為對(duì)照組，右側(cè)條為實(shí)驗(yàn)組。1.3 小鼠冠狀動(dòng)脈組織病理學(xué)改變1.3.1 HE 染色。對(duì)照組：血管內(nèi)皮完整光滑，內(nèi)膜下彈力纖維完整，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖 1-3：A）。實(shí)驗(yàn)組：急性期（3d）可見(jiàn)血管內(nèi)皮粗糙，有明顯炎癥細(xì)胞

圖 1-3 注：免疫性血管炎病理改變（HE 染色）：A：對(duì)照組。（HE×200）（對(duì)照組紅色箭頭：內(nèi)膜光滑的冠狀動(dòng)脈）。B：實(shí)驗(yàn)組（HE×200）。（注射 CAWS 后 3d，紅色箭頭：內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、內(nèi)膜毛糙的冠狀動(dòng)脈）。C：實(shí)驗(yàn)組（HE×200）。（注射 CAW后 14d，藍(lán)色箭頭：血管內(nèi)膜及彈力纖維損傷，紅色箭頭：炎癥腫脹的血管）。按照 Oharaseki T[7]的方法，按血管炎癥程度等級(jí)給予 0、1、2、3 分的評(píng)分，以Ridit 分析法半定量分析，隨著 CAWS 刺激中止后日齡的變化，血管損傷在 14d 最重28d 漸恢復(fù)。與對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表 1-7：表 1-7：各組小鼠血管炎癥損傷評(píng)分（n=6， x±s）組別 血管損傷分值對(duì)照組 0.00±0.0024h 0.73±0.43*3d 1.14±0.36*7d 2.26±0.45*14d 2.38±0.52*

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2752105