【摘要】： 新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是指圍產(chǎn)期窒息導(dǎo)致腦的缺氧缺血性損傷,而出現(xiàn)的一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常的表現(xiàn),是新生兒期腦損傷的最常見原因,也是導(dǎo)致兒童發(fā)生嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的主要原因。目前HIE的發(fā)病機制研究雖然取得了很大進(jìn)展,但是臨床上對HIE仍然缺乏特效治療方法。 目前比較有前途的可用于治療新生兒HIE的方法主要有三種:1)頭部亞低溫;2)干細(xì)胞移植;3)高壓氧(hyperbaric oxygen,HBO)治療。頭部亞低溫治療新生兒HIE有一定近期療效,但治療窗較窄,一般要求在出生6小時內(nèi)開始治療,且對HIE的遠(yuǎn)期后遺癥的改善效果不明顯[Gluckman,2005],因此還難以在臨床廣泛推廣。干細(xì)胞移植是指用某種外源性干細(xì)胞移植至體內(nèi),目前仍處于動物試驗的基礎(chǔ)研究階段。而且存在著供體來源、宿主移植物排異和倫理道德等問題,使得其在臨床上的應(yīng)用受到限制。 長期以來,人們認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后不能修復(fù),但近年來在對神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)的研究中,人們發(fā)現(xiàn)在大腦的某些部位如側(cè)腦室室管膜下(subventricular zone,SVZ)和海馬DG區(qū)(hippocampal dentate gyrus,DG)終身存在著內(nèi)源性的神經(jīng)干細(xì)胞,在某些病理損傷的情況下,腦損傷可刺激體內(nèi)生發(fā)區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化,進(jìn)行自我修復(fù)[Maslov,2004]。已經(jīng)有文獻(xiàn)報道,新生大鼠在缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)后腦內(nèi)源性NSCs有增殖和分化現(xiàn)象[Hayashi,2005]。但是內(nèi)源性干細(xì)胞不僅數(shù)量有限,而且受到神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、軸突生長抑制因子存在等影響因素,大腦的這種自身修復(fù)潛能有限,因此能夠找到一種將大腦自身修復(fù)功能擴大的方法將為HIE治療帶來廣闊的前景。 HBO目前已經(jīng)應(yīng)用于新生兒HIE的治療已有數(shù)十年歷史。我國從上世紀(jì)90年代開始應(yīng)用HBO治療HIE以來,大部分文獻(xiàn)報道均認(rèn)為HBO可減輕患兒癥狀,降低病死率和傷殘率[胡電,2004;蓋勇,2005]。我們最近的研究也已證實,HBO不僅可促進(jìn)缺氧缺血腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖[余小河2006],并且還可促進(jìn)增殖的內(nèi)源性NSCs向損傷的大腦皮層遷移并分化為成熟的神經(jīng)元[王曉莉,2008]。 已有不少實驗研究結(jié)果提示HBO治療新生大鼠HIBD的有效時間窗為6～12 h。然而,臨床上HBO治療新生兒HIE一般要在生后1周左右開始,治療2～3個療程。有不少報道用這種方法治療是有效療的。為何HBO治療的時間窗在實驗研究與臨床實踐之間有較大的差異呢?其原因尚不清楚。為此我們提出假設(shè),增加HBO的療程可以延長其治療的時間窗。那么,增加HBO的治療時間或療程后是否能夠增強NSCs的增殖和分化呢?目前國內(nèi)外的研究都只給1個療程(5～7次),甚至1次的HBO治療,尚未見到多療程HBO對HIBD新生大鼠影響的文獻(xiàn)報道。如果能夠通過實驗證實多療程HBO能夠延長治療的時間窗,并提高療效的話,這將為臨床HBO治療新生兒HIE的實施提供理論依據(jù)。 本研究分為三部分: 第一部分實驗觀察在常規(guī)的治療時間窗(HIBD后2 h)開始多個療程的HBO治療對HIBD新生大鼠行為學(xué)和組織學(xué)的影響。研究結(jié)果顯示了在HIBD后2 h給予1個療程的HBO治療即能夠使神經(jīng)元凋亡減少至接近正常,因此,即使再增加療程也不再顯示對神經(jīng)元凋亡的抑制作用了。但是對HIBD新生大鼠行為學(xué)的改善卻隨著療程的增加而增加。這一結(jié)果提示增加HBO的療程可增強對行為學(xué)損害的保護(hù)作用,而這種保護(hù)作用的機制除了減少神經(jīng)元凋亡以外,可能還存在著其它原因。根據(jù)我們最近的實驗發(fā)現(xiàn)HBO治療可促進(jìn)HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖與分化[余小河,2004;王曉莉,2007:Yang YJ,2008],為此我們提出假設(shè),增加HBO療程能夠增強對行為學(xué)損害的保護(hù)作用的機制與增強了促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增殖與分化的作用有關(guān)。在這基礎(chǔ)上設(shè)計了第二部分實驗。 第二部分實驗觀察了在常規(guī)的治療時間窗(HIBD后2 h)開始多個療程的HBO治療對HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖與分化。實驗結(jié)果證實了增加HBO療程確實可增強HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖,并分化為神經(jīng)元。有了這一結(jié)果,進(jìn)一步我們就可以開始探討延長HBO治療時間窗后,是否可通過增加療程來提高療效。 第三部分實驗主要探討在HIBD后48 h和96 h開始不同療程的HBO治療對HIBD新生大鼠有否保護(hù)作用。結(jié)果是肯定的,證明了即使是長達(dá)96 h的時間窗開始HBO治療,通過增加療程也可獲得明顯的保護(hù)作用。 各部分的具體內(nèi)容如下。 一、不同療程HBO對HIBD新生大鼠行為學(xué)及組織學(xué)的影響 目的通過觀察多療程HBO治療對HIBD新生大鼠腦部病變和遠(yuǎn)期行為學(xué)的影響,探討增加HBO的療程是否能夠提高其療效。 方法7日齡Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機分為5組:1)正常對照組(CON,n=10),2)缺氧缺血腦損傷組(HIBD,n=10),3)高壓氧1療程組(HBO-1,n=10),4)高壓氧2療程組(HBO-2,n=10),5)高壓氧3療程組(HBO-3,n=10)。HIBD組按照Rice-Vannucci方法制作新生大鼠HIBD模型。高壓氧治療組在HIBD模型制成后2小時開始治療,艙內(nèi)壓力2 ATA,穩(wěn)壓60 min,每日1次,7次為1個療程。休息3天再進(jìn)行下一個療程。療程結(jié)束后,各組均等到鼠齡35天時進(jìn)行T迷宮試驗、放射臂迷宮試驗、足錯誤等行為學(xué)測試。測試完成后(鼠齡46天)處死動物,10%水合氯醛麻醉后打開胸腔,于心尖部插管注入生理鹽水,待流出液清亮后,再注入4%多聚甲醛灌注固定,斷頭取腦,取出左側(cè)大腦半球用4%多聚甲醛固定24h后石蠟包埋、固定、脫水后,切片機在前囟前1.0至-0.8mm冠狀位連續(xù)切片,片厚4μm,行TUNEL法觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡和尼氏染色觀察腦組織病理改變。 結(jié)果(1)HBO組行為學(xué)測試結(jié)果優(yōu)于HIBD組;(2)T迷宮測試中,隨著天數(shù)的增加,正常組和HBO組的正確率逐漸增高;而且隨著HBO療程的增加,正確率逐漸增加,訓(xùn)練至第3天時,HBO-3組正確率明顯高于HBO-1(P＜0.05)。(3)放射臂迷宮測試中,隨著HBO療程的增加,覓水時間逐漸減少,HB0-3組所需時間明顯少于HBO-1和HBO-2組(P＜0.01);隨著HBO療程的增加,平均錯誤次數(shù)和重復(fù)次數(shù)逐漸減少,其中HBO-3組重復(fù)次數(shù)明顯低于HBO-1和HBO-2組(P＜0.01)。(4)足錯誤測試中,HIBD組右左差值較對照組、HBO-2、HBO-3組高(P＜0.05),隨著HBO療程的增加,足錯誤次數(shù)減少。(4)TUNEL染色顯示HBO治療可抑制HIBD新生大鼠皮層神經(jīng)元凋亡,但各療程組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。(5)尼氏染色顯示HBO治療可使皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失較HIBD組顯著減少,但各療程組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論(1)在短時間窗(2h)開始HBO治療,對HIBD新生大鼠行為學(xué)損害的保護(hù)作用隨著療程增加而增加。(2)在短時間窗(2h)開始一個療程HBO治療,已經(jīng)能夠明顯抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,增加療程不再加強這一作用。 二、不同療程HBO對HIBD新生大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化的影響 目的第一部分的研究結(jié)果顯示了在HIBD后2 h給予1個療程的HBO治療即能夠明顯抑制神經(jīng)元凋亡,再增加療程已無法顯示抗凋亡作用的繼續(xù)增強。但是隨著療程的增加,HBO對HIBD新生大鼠遠(yuǎn)期行為學(xué)的改善更為明顯。為此我們推測是否增加HBO的療程可通過刺激內(nèi)源性NSCs的增殖和分化來加強對行為學(xué)損傷的保護(hù)作用的。因此,本研究通過觀察增加HBO療程是否能夠增強刺激HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖和分化。 方法7日齡SD大鼠隨機分為5組:1)正常對照組(CON,n=20),2)缺氧缺血腦損傷組(HIBD,n=20),3)高壓氧1療程組(HBO-1,n=20),4)高壓氧2療程組(HBO-2,n=20),5)高壓氧3療程組(HBO-3,n=20)。HIBD模型制作與HBO治療方法同第一部分。每組各取10只動物在第三個療程完成前48小時(即鼠齡33天時)腹腔注射BrdU(每次50 mg/kg,每8小時注射1次,連續(xù)5次)。各組動物均等到鼠齡35天時處死(方法同第一部分)取腦組織切片,采用BrdU/Nestin免疫熒光雙標(biāo)法檢測缺血側(cè)側(cè)腦室室管膜下區(qū)(SVZ區(qū))和海馬齒狀回(DG區(qū))的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的變化;免疫熒光雙標(biāo)法檢測大腦皮層BrdU/NSE和BrdU/GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量。同時每組另外的10只動物用10%水合氯醛麻醉后斷頭處死,取缺血側(cè)大腦半球全層腦組織約100mg,采用Western blot法檢測缺血側(cè)大腦半球nestin總蛋白的變化。 結(jié)果1)HBO治療后SVZ區(qū)BrdU~+/nestin~+細(xì)胞隨療程增加而增多,以HBO-3組的陽性細(xì)胞數(shù)最多,明顯高于HIBD和HBO—1組(P＜0.01);2)各組大鼠的海馬DG區(qū)均只有極少量的BrdU~+/nestin~+細(xì)胞表達(dá),而且隨著HBO療程增加,BrdU~+/nestin~+細(xì)胞表達(dá)沒有增加;3)大腦皮層BrdU~+/NSE~+細(xì)胞隨著HBO療程增加逐漸增多,其中以HBO-3組的陽性細(xì)胞數(shù)最多,高于HIBD和HBO-1組(P＜0.05);4)HIBD組可見較多GFAP~+細(xì)胞,而各療程HBO治療組GFAP~+細(xì)胞均明顯減少;而且各組均只有少量BrdU~+/GFAP~+細(xì)胞;5)Western blot顯示HBO-3組nestin蛋白表達(dá)高于HIBD、HBO-1和HBO-2組(P＜0.01)。 結(jié)論HIBD后2小時給予HBO治療,通過增加HBO療程可促進(jìn)HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖,并分化為神經(jīng)元。 三、增加HBO療程對延遲治療時間窗的新生大鼠HIBD療效觀察 目的已有不少實驗研究結(jié)果提示HBO治療新生大鼠HIBD的有效時間窗為6～12 h。然而,臨床上HBO治療新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy.HIE)一般要在生后1周左右開始,治療2～3個療程。有不少報道用這種方法治療是有效療的。為何HBO治療的時間窗在實驗研究與臨床實踐之間有較大的差異原因不清楚。根據(jù)我們前面的研究結(jié)果,在HIBD后2小時開始給予一個療程的HBO即可有效地抑制神經(jīng)元凋亡的發(fā)生,對神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用。那么在時間窗延遲時,增加HBO療程是否也能夠?qū)p傷的神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用呢?為此我們提出假設(shè),增加HBO的療程可以延長其治療的時間窗。本研究旨在探討多療程的HBO治療是否對96 h的時間窗的HIBD新生大鼠有保護(hù)作用。增加HBO療程能夠更好地減輕HIBD新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。 方法7日齡SD大鼠(88只),隨機分為11個組(n=8),包括正常對照組(CON)、缺氧缺血腦損傷組(HIBD)和高壓氧組(HBO);HBO組根據(jù)HBO不同時間窗分為2h高壓氧組(2H,在HIBD后2h開始給予HBO)、48h高壓氧組(48H,HIBD后48h給予HBO)及96h高壓氧組(96H,HIBD后96h給予HBO)等三個亞組;各亞組又根據(jù)不同療程分成一療程組(HBO-1)、二療程(HBO—2)和三療程組(HBO-3)等組。各組在HBO療程完成后置于空氣中喂養(yǎng),待96H的三療程組完成全部療程后,即鼠齡38天(HIBD后31天)時一同處死,采用TUNEL染色檢測各組大腦皮層和海馬CA1區(qū)凋亡;并采用NSE免疫組化方法檢測各組皮層神經(jīng)元數(shù)量。 結(jié)果(1)HIBD組凋亡細(xì)胞明顯高于CON組,同時NSE陽性細(xì)胞明顯少于CON組(P＜0.01);(2)隨著時間窗的延長HBO對凋亡的抑制作用隨之減弱,其中以96H組對凋亡的抑制作用最弱,但三個時間窗組與HIBD組比較,對凋亡的抑制作用差異均有顯著意義(P＜0.01)。同時隨著時間窗的延長,HBO對神經(jīng)元的保護(hù)作用逐漸減弱,表現(xiàn)為NSE陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,但仍然多于HIBD組(P＜0.01);(3)HBO對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用隨著療程的增多而增強;同時隨著療程增加,HBO對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用逐漸增強,NSE陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多;但是2小時時間窗組(2H組)經(jīng)過一療程HBO治療后,凋亡細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)減少至接近正常組,而且NSE陽性細(xì)胞數(shù)量的增加也接近正常組,因此隨著療程增加,不再顯示抗凋亡和保護(hù)神經(jīng)元作用的繼續(xù)增強。 結(jié)論(1)HIBD后2小時給予一療程的HBO治療即可明顯抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及保護(hù)神經(jīng)元;(2)隨著HBO開始治療的時間窗的延遲,一個療程的HBO對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用逐漸減弱,但通過增加療程可增強對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制與對神經(jīng)元的保護(hù)作用。 綜上所述,本研究結(jié)論如下: 1、HIBD后2小時給予HBO可對HIBD新生大鼠的遠(yuǎn)期腦功能有修復(fù)作用。而且隨著HBO療程的增加,大鼠行為學(xué)改善的效果更為顯著 2、在HIBD后2小時給予HBO治療,增加HBO的療程可促進(jìn)HIBD新生大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,并分化為神經(jīng)元。 3、HIBD后2小時給予一療程的HBO治療即可明顯抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及保護(hù)神經(jīng)元;隨著HBO開始治療的時間窗的延遲,通過增加療程可增強抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用和對神經(jīng)元的保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R722.121
【圖文】：

咨協(xié)滬、產(chǎn)，、飛Jl’﨑r卜味附圖1一2各組大氛皮層尼氏染色結(jié)果〔400x)注:CON組中可見大量尼氏染色陽性的神經(jīng)元;HIBD組神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，形態(tài)不規(guī)則;各HBO組皮層尼氏染色陽性的神經(jīng)元數(shù)量都有明顯增高，其中尤其是HBO一3組的神經(jīng)元數(shù)量最多，己接近C()N組。

一少口一，·{孫’“·HBO-~一一卜.幾、，今--叫卜.附圖1一1各組大鼠皮層細(xì)胞TuNEL染色 (400x)注:CON組基本上無陽性細(xì)胞:HIBD組可見大量棕色的凋亡陽性細(xì)胞;各療程HBO組凋亡細(xì)胞數(shù)量均有明顯減少，但各11BO療程組之間無差別。今e0N人戶矜﨑節(jié)于訊棄咋子“，‘戈-‘心，，.‘_確耳’氣內(nèi)、，乃定少二:幾獷-、平七，勺，卜，、咨協(xié)滬、產(chǎn)，、飛Jl’﨑r卜味附圖1一2各組大氛皮層尼氏染色結(jié)果〔400x)注:CON組中可見大量尼氏染色陽性的神經(jīng)元;HIBD組神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，形態(tài)不規(guī)則;各HBO組皮層尼氏染色陽性的神經(jīng)元數(shù)量都有明顯增高

一少口一，·{孫’“·HBO-~一一卜.幾、，今--叫卜.附圖1一1各組大鼠皮層細(xì)胞TuNEL染色 (400x)注:CON組基本上無陽性細(xì)胞:HIBD組可見大量棕色的凋亡陽性細(xì)胞;各療程HBO組凋亡細(xì)胞數(shù)量均有明顯減少，但各11BO療程組之間無差別。今e0N人戶矜﨑節(jié)于訊棄咋子“，‘戈-‘心，，.‘_確耳’氣內(nèi)、，乃定少二:幾獷-、平七，勺，卜，、咨協(xié)滬、產(chǎn)，、飛Jl’﨑r卜味附圖1一2各組大氛皮層尼氏染色結(jié)果〔400x)注:CON組中可見大量尼氏染色陽性的神經(jīng)元;HIBD組神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，形態(tài)不規(guī)則;各HBO組皮層尼氏染色陽性的神經(jīng)元數(shù)量都有明顯增高

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 游文;;高壓氧綜合治療重型顱腦外傷的護(hù)理探討[J];中外醫(yī)療;2012年35期

本文編號：2744968