【摘要】： 第一部分HDM刺激小鼠肺SMAD蛋白表達(dá) 目的:探討屋塵螨(HDM)氣道刺激后,不同遺傳背景小鼠肺組織SMAD蛋白表達(dá)有何不同。 方法:將A/J和C3H小鼠分別用HDM氣道刺激,在最后一次刺激16小時(shí)后,取肺組織,經(jīng)過勻漿處理,提取核蛋白,用western blot免疫印跡法檢測(cè)肺組織蛋白中Smad2/3、Smad6的表達(dá)。 結(jié)果: A/J和C3H小鼠在HDM氣道刺激16小時(shí)后,肺組織Smad6蛋白表達(dá)差異明顯,表現(xiàn)為A/J小鼠Smad6升高,而C3H則呈現(xiàn)于A/J相反得變化,Smad6表達(dá)降低,而Smad2/3表達(dá)則正好相反,A/J降低,C3H增高。 結(jié)論:經(jīng)HDM氣道刺激后,不同遺傳背景小鼠Smad表達(dá)有所差異,需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證其在TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。 第二部分針對(duì)小鼠Smad6基因的RNA干擾 目的:針對(duì)目的基因Smad6 CDS區(qū)設(shè)計(jì)siRNA序列,構(gòu)建表達(dá)載體,探討感染后BMDC細(xì)胞中Smad6基因和蛋白表達(dá)狀況。 方法:針對(duì)目的基因Smad6 CDS區(qū)設(shè)計(jì)三條siRNA序列,分別為siRNA1、siRNA2、siRNA3 ,使用siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector進(jìn)行siRNA表達(dá)載體構(gòu)建,對(duì)構(gòu)建成功的siRNA重組表達(dá)載體進(jìn)行去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA抽提,siRNA重組表達(dá)載體DNA轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞,然后Real-time PCR的方法檢測(cè)基因干預(yù)后L929細(xì)胞中Smad6基因表達(dá)狀況,使用Lentivirus Pakage systerm進(jìn)行慢病毒顆粒的包裝和生產(chǎn),測(cè)定病毒滴度(梯度稀釋法),再分離C3H/HeJ小鼠骨髓原代BMDC,獲取最佳MOI值以及感染條件,后用慢病毒感染BMDC細(xì)胞,RT-PCR和western blot分別檢測(cè)感染后細(xì)胞中Smad6基因的表達(dá)及SMAD6蛋白表達(dá)狀況。 結(jié)果: Real Time-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,siRNA1對(duì)于Smad6基因的沉默效果最好,沉默效率約為67%�？紤]到細(xì)胞大約75%的轉(zhuǎn)染效率,實(shí)際的基因沉默可能達(dá)到90%(mRNA),最佳MOI值為20,Real Time-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,通過病毒載體感染BMDC細(xì)胞,提示siRNA1對(duì)于Smad6基因的沉默效約為85%,而BMDC中蛋白表達(dá)被明顯抑制,與對(duì)照組有差異有顯著性。 結(jié)論:我們針對(duì)目的基因Smad6 CDS區(qū)所設(shè)計(jì)的siRNA序列而構(gòu)建的表達(dá)載體能成功有效抑制Smad6基因和蛋白表達(dá),為后一步的試驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R725.6
【圖文】：

圖 1-2 HDM 氣道刺激后小鼠肺組織 Smad2/3 蛋白表達(dá)Fig 1-2 Active Smad2/3 expression in nucleus from whole lung cells從圖中可以看出，沒有經(jīng)過 HDM 氣道刺激的 A/J 和 C3H 小鼠 Smad2/3 表達(dá)基本沒有差異，而經(jīng)過 HDM 氣道刺激后，二種小鼠均出現(xiàn)變化，具體表現(xiàn)為：A/J 下降，C3H 升高；而 HDM 刺激后 16 小時(shí)，A/J 和 C3H 的 Smad2/3 表達(dá)也存在明顯差異。（統(tǒng)計(jì)學(xué)比較：A/J 未刺激與 2h、6h、16h 兩兩比較均有差異，C3H未刺激與 2h、6h 比較有差異，與 16h 比較有顯著差異，2h、6h、16h 之 A/J 與 C3H比較有顯著差異，p<0.05）。2.2 HDM 氣道刺激誘導(dǎo)小鼠肺組織核內(nèi) Smad6 表達(dá)

010203040506070unchallenged 2 h 6 h 16 h分組密光度值A(chǔ)/JC3H***圖 1-3 HDM 氣道刺激后小鼠肺組織 Smad6 蛋白表達(dá)Fig 1-3 Smad6 expression in nucleus from whole lung cells* vs 未刺激 A/J(unchallenged A/J)** 16h C3H vs 16h A/J,p<0.05

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 魯繼榮,劉文東,趙凱姝,孫明遠(yuǎn),付文永;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β_1基因多態(tài)性與兒童哮喘易感性研究[J];臨床兒科雜志;2004年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 劉阿茹;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1對(duì)哮喘氣道重建的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

2 蔣雄斌;CD8～+T細(xì)胞在呼吸道合胞病毒誘導(dǎo)的哮喘中的作用研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2006年

3 宋云熙;大劑量過敏原誘導(dǎo)致敏小鼠T細(xì)胞不反應(yīng)性及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

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1 張躍文;青霉素過敏反應(yīng)與IL-4、IL-13、IFN-γ及其相關(guān)基因多態(tài)性的臨床研究[D];鄭州大學(xué);2003年

2 米永杰;TSP-1活化TGF-β_1在慢性移植腎病中作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

3 郝長(zhǎng)付;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1基因多態(tài)性與煤工塵肺關(guān)系研究[D];鄭州大學(xué);2006年

4 李莉;哮喘患兒誘導(dǎo)痰中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、白介素13與氣道重塑關(guān)系的探討[D];南昌大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2737620