【摘要】：圓錐動(dòng)脈干畸形是一類復(fù)雜型先心病,可以導(dǎo)致新生兒時(shí)期出現(xiàn)低氧血癥和難以糾正的酸中毒,引起患兒早期死亡。先心病是多基因與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果,遺傳因素日益受到重視。VANGL2、TGFβ2和PAX3基因敲除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均出現(xiàn)了圓錐動(dòng)脈干畸形的表現(xiàn),因而被認(rèn)為是圓錐動(dòng)脈干畸形發(fā)病的候選基因。然而,在人類圓錐動(dòng)脈干畸形與VANGL2、TGFβ2和PAX3基因的研究還非常有限。本課題擬研究法洛四聯(lián)癥患兒的VANGL2、TGFβ2和PAX3等三個(gè)基因的外顯子區(qū)及5’非編碼區(qū)(5’-UTR區(qū))的基因序列、甲基化水平以及其在右室流出道心肌組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平,探討VANGL2、TGFβ2和PAX3基因與法洛四聯(lián)癥的關(guān)系,為深入研究以法洛四聯(lián)癥為代表的圓錐動(dòng)脈干畸形的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)和基礎(chǔ)。 第一部分法洛四聯(lián)癥患兒VANGL2、TGFβ2、PAX3基因序列研究 目的： 探討法洛四聯(lián)癥患兒VANGL2、TGFβ2、PAX3基因的序列變化,觀察這些基因是否為法洛四聯(lián)癥發(fā)病的候選易感基因。 方法： 應(yīng)用PCR技術(shù)以及測(cè)序方法,對(duì)100例法洛四聯(lián)癥患兒、200例心臟結(jié)構(gòu)正常的健康兒童,對(duì)VANGL2、TGFβ2和PAX3基因編碼區(qū)外顯子和其上游5’-非編碼區(qū)前1500bp左右的堿基序列進(jìn)行測(cè)序。對(duì)VANGL2、TGFβ2和PAX3基因序列變化與圓錐動(dòng)脈干畸形的關(guān)系進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1、VANGL2基因序列分析 檢測(cè)VANGL2基因的全部編碼區(qū)外顯子序列和第一外顯子上游1500bp的5’-UTR區(qū)域序列,發(fā)現(xiàn)3種多態(tài)類型,其中第7外顯子的33543位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)等位基因A、G改變,在第8外顯子34641位點(diǎn)等位基因G、A改變位于基因編碼區(qū)內(nèi),未造成編碼氨基酸的改變,且在病例組和對(duì)照組間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5’-UTR區(qū)的9010位點(diǎn)存在T、G等位基因改變,在兩組間基因型差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X2=6.865,P=0.032),認(rèn)為5’-UTR區(qū)9010位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性改變可能與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān)。 2、TGF β2基因序列分析 檢測(cè)TGF β2基因的全部編碼區(qū)外顯子序列和第一外顯子上游1500bp的5’-UTR區(qū)域序列,在編碼區(qū)全部8個(gè)外顯子區(qū)未發(fā)現(xiàn)基因序列改變,在5’-UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),其中9126位點(diǎn)等位基因A、C改變和9353位點(diǎn)等位基因A、G改變?cè)诓±M和對(duì)照組中無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而9040_9043位點(diǎn)在部分病例組合對(duì)照組中出現(xiàn)CTTC片段缺失,且兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=17.469,P0.001),考慮5’-UTR區(qū)9040_9043位點(diǎn)的多態(tài)性改變與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān),推測(cè)CTTC片段的表達(dá)可能是法洛四聯(lián)癥的危險(xiǎn)因素(OR=3.692,95%CI：1.971-6.917)。 3.PAX3基因序列分析 檢測(cè)PAX3基因的全部編碼區(qū)外顯子序列和第一外顯子上游1500bp的5’-UTR區(qū)域序列,在編碼區(qū)第2外顯子的95457位點(diǎn)上所有的病例組和對(duì)照組均表現(xiàn)為GG純合子改變,考慮為中國(guó)人群的正常堿基序列。在5’-UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)病例組有2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),其中97596位點(diǎn)表現(xiàn)為G、C等位基因單核苷酸多態(tài)性改變,且兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X2=4.367,P=0.037),推測(cè)該位點(diǎn)多態(tài)性可能與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān)；在97632_97655位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)兩組均有部分樣本出現(xiàn)12個(gè)GT重復(fù)片段缺失改變,且兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X2=72.0,P0.001),推測(cè)5’-UTR區(qū)97632_97655位點(diǎn)多態(tài)性改變與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān),且12個(gè)GT重復(fù)片段的表達(dá)可能是法洛四聯(lián)癥的危險(xiǎn)因素(OR=16,95%CI：8.002-31.994)。 在PAX3基因5’-UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變位點(diǎn),其中在100例病例組中,有5例法洛四聯(lián)癥患兒表現(xiàn)有97654_97655位點(diǎn)的一個(gè)GT片段缺失改變,1例法洛四聯(lián)癥患兒98064位點(diǎn)出現(xiàn)GGA的改變,認(rèn)為是中國(guó)人群中法洛四聯(lián)癥患兒的突變位點(diǎn)。 小結(jié)： 1、VANGL2基因5’-UTR區(qū)9010位點(diǎn)T/G單核苷酸的多態(tài)性可能與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān)。 2、TGF β2基因5'-UTR區(qū)域9040_9043位點(diǎn)CTTC片段缺失改變與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān),推測(cè)CTTC片段的表達(dá)可能是法洛四聯(lián)癥的危險(xiǎn)因素。 3、PAX3基因5’-UTR區(qū)域97596位點(diǎn)G/C單核苷酸多態(tài)性可能與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān),97632_97655位點(diǎn)12個(gè)GT重復(fù)片段缺失改變與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān),該位點(diǎn)12個(gè)GT片段的表達(dá)可能是法洛四聯(lián)癥的危險(xiǎn)因素。 4、PAX3基因5’-UTR區(qū)域97654_97655位點(diǎn)的單個(gè)GT片段缺失和5’-UTR區(qū)域98064位點(diǎn)GGA的改變是中國(guó)人群中法洛四聯(lián)癥患兒的突變位點(diǎn)。 第二部分VANGL2、TGFβ2、PAX3基因在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中甲基化及表達(dá)差異的初步研究 目的： 觀察VANGL2、TGFβ2、PAX3基因在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中甲基化及表達(dá)差異,探討這些基因在法洛四聯(lián)癥發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法： 選取5例法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織作為研究對(duì)象,通過MBD柱層析與甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶聯(lián)用法(COMPARE-MS)觀察VANGL2, TGF β2, PAX3基因在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中甲基化水平變化；應(yīng)用real-time PCR和免疫組化的方法檢測(cè)VANGL2、TGFβ2、PAX3基因在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中的表達(dá)差異。 結(jié)果： 1、法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織VANGL2、TGFβ2和PAX3基因5’-UTR區(qū)甲基化水平較對(duì)照組均降低。 2、TGFβ2、PAX3基因mRNA在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中表達(dá)明顯高于對(duì)照組。VANGL2基因mRNA在在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中表達(dá)明顯低于對(duì)照組。 3、PAX3蛋白表達(dá)水平在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中明顯高于對(duì)照組。TGFβ2蛋白在心肌細(xì)胞中表達(dá)水平在病例組和對(duì)照組間差異不明顯,但在病例組可見心肌細(xì)胞周圍的間質(zhì)組織中有TGF β2蛋白的表達(dá)。VANGL2蛋白在病例組心肌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。 小結(jié)： 1、PAX3和TGFβ2基因的表達(dá)升高可能與法洛四聯(lián)癥的發(fā)生有關(guān)。PAX3和TGFβ2基因甲基化水平降低可能與其表達(dá)水平升高有關(guān)。 2、VANGL2基因在心肌組織中的低表達(dá)可能與法洛四聯(lián)癥的發(fā)生有關(guān)。VANGL2基因mRNA和蛋白水平低表達(dá)可能與該基因甲基化降低有關(guān),但可能還受到其他調(diào)控因素的影響。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R725.4

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本文編號(hào)：2734634