【摘要】： 背景: 急慢性肺損傷是造成新生兒尤其是早產(chǎn)兒死亡、傷殘的主要原因之一,不成熟肺組織長時間暴露于高氧環(huán)境是導致急慢性肺損傷發(fā)生發(fā)展的重要因素。動物研究表明,在肺泡形成關鍵時期,長時間高氧暴露可阻礙肺泡間隔形成,使肺泡數(shù)目減少、呼吸膜內表面積減小和肺泡腔體積增大,與支氣管肺發(fā)育不良(BPD)患兒肺部病理特征極其相似。同時,持續(xù)高氧暴露可促發(fā)肺部廣泛炎癥反應,導致肺泡毛細血管內皮細胞和上皮細胞壞死、凋亡,損害肺泡—毛細血管屏障功能;促使間質成纖維細胞向肺泡腔遷移、增生,并產(chǎn)生膠原蛋白沉積于肺泡腔,導致肺纖維化的發(fā)生。 基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組依賴鋅離子的中性蛋白酶,它們是降解細胞外基質(ECM)的主要介質,并與其特異性組織抑制物(TIMPs)一起參與了體內許多生物學過程,如胚胎發(fā)育、支氣管分枝形成、血管發(fā)生、炎癥過程以及損傷修復等。MMP-2、MMP-9又稱明膠酶-A、明膠酶-B。在肺組織發(fā)育過程中,MMP-2和MMP-9的一個重要功能就是裂解ECM成分,產(chǎn)生具有生物學活性的片段,從而誘導肺泡上皮細胞的遷移以及肺分枝形態(tài)的發(fā)生,因此它們對于胚胎期以及出生后肺發(fā)育起至關重要的調控作用。我們以及其他研究者研究證實,高氧暴露引起早產(chǎn)大鼠急性肺損傷和肺發(fā)育阻滯同時,肺組織MMP-2、MMP-9表達水平和MMPs/TIMPs比值明顯升高,ECM降解加速,肺組織發(fā)生廣泛重塑,最終導致肺發(fā)育受阻。 肺泡上皮主要由Ⅰ型(AECⅠ)和П型肺泡上皮細胞(AECⅡ)組成。AECⅡ是肺內主要干細胞,肺泡上皮損傷修復的唯一途徑是AECⅡ增殖、遷移并向AECI轉化,從而使肺泡壁重新上皮化以恢復氣血屏障。在肺發(fā)育和損傷修復過程中,肺細胞增殖及凋亡行為受多種因素的精細調控。研究表明,高氧暴露可導致肺細胞DNA損傷,誘導腫瘤抑制蛋白p53及其下游靶基因表達,使細胞周期阻滯于G1/S期,以利于DNA修復;若DNA修復不成功,則誘導細胞發(fā)生凋亡。 絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是細胞增殖、分化、凋亡等信息傳遞途徑的交匯點和共同通路,細胞外各種刺激信號可通過不同的細胞內信息傳遞系統(tǒng),共同交匯于MAPKs。一旦被激活,MAPKs通過使其下游的轉錄因子磷酸化來調控靶基因表達。近年來研究表明,MAPK信號傳遞通路在MMPs/TIMPs的表達調控中扮演重要角色;并且還參與了肺發(fā)育和高氧肺損傷過程中細胞增殖和凋亡的調節(jié)。但MAPK信號傳遞通路是否參與高氧暴露下不成熟肺組織MMPs/TIMPs的表達調控?目前尚未見報道。 兩個大樣本臨床隨機研究證實,維生素A是迄今為止唯一能降低BPD發(fā)生率和死亡率且無明顯毒副作用的藥物,但其作用機制尚未明了。維甲酸(RA)是維生素A在生物體內的重要活性形式,調節(jié)包括細胞生長、分化、發(fā)育和腫瘤發(fā)生等在內的多種重要生物學功能。研究表明,RA不僅能促進發(fā)育期大鼠肺泡形成,還能促進成熟肺組織損傷后的修復過程。給予外源性RA可改善肺泡結構、降低肺纖維化程度,對新生大鼠高氧肺損傷具有保護作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),RA對多種肺損傷的保護作用可能與調節(jié)MMPs/TIMPs的表達有關。那么,RA是否參與高氧暴露下肺組織MMPs/TIMPs表達調控?RA調節(jié)高氧暴露下肺組織MMPs/TIMPs的表達是否與調控MAPKs功能狀態(tài)有關?迄今尚未見報道。另外,研究證實,RA還參與了細胞周期調控。那么,RA對高氧肺損傷時肺細胞凋亡、增殖的影響是否也與調節(jié)MAPKs的活性有關?目前尚不清楚。 目的: 通過建立早產(chǎn)大鼠高氧暴露動物和細胞模型, 1、進一步闡明MMPs/TIMPs在高氧肺損傷中的作用; 2、探討MAPKs(ERK1/2、JNK1/2和p38)是否參與高氧暴露下MMPs/TIMPs的表達調控; 3、探討RA是否通過調控MAPKs功能狀態(tài)調節(jié)MMPs/TIMPs的表達,從而發(fā)揮高氧肺損傷保護作用; 4、從細胞增殖和凋亡角度,進一步論證RA高氧肺損傷保護作用機制。為RA的臨床應用提供理論依據(jù)。 方法: 1、剖宮取出孕21 d(足月為22 d)SD早產(chǎn)鼠,隨機分為4組:I、空氣組;II、高氧組;III、空氣+RA組;IV、高氧+RA組,I、III組置于空氣中,II、IV組置于85 % O2中,III、IV組每日腹腔注射RA(500μg / kg)。于4 d、7 d、14 d收集肺組織標本,采用RT-PCR方法檢測MMP-2、MMP-9、MT1-MMP、TIMP-1和TIMP-2 mRNA表達,采用明膠酶譜法檢測MMP-2和MMP-9酶原及活酶表達,運用Western blot技術對TIMP-1、TIMP-2、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、p-p38、p38蛋白表達進行檢測。 2、原代培養(yǎng)早產(chǎn)鼠(孕19 d～20 d)AECII和肺成纖維細胞(LFs),待其生長至亞匯合狀態(tài)時,將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液換成含2 % FCS的MEM,并隨機分為四組:I、空氣組,II、高氧組,III、空氣+RA組,IV、高氧+RA組。其中,III、IV組培養(yǎng)液中加入含有終濃度為1×10-6 mol/L的RA,I、II組培養(yǎng)液中加入含有相同終濃度的無水乙醇。I、III組置于空氣中,II、IV組置于90 %高氧中。于培養(yǎng)2、6、12和24 h時提取細胞總RNA,采用RT-PCR方法檢測MMP-2、MT1-MMP、和TIMP-2 mRNA表達;提取12 h和24 h細胞總蛋白及培養(yǎng)上清濃縮液,采用明膠酶譜法檢測細胞總蛋白與培養(yǎng)上清混合液中MMP-2和MMP-9酶原及活酶表達,采用Western blot技術檢測p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、p-p38和p38蛋白表達;提取12 h和24 h細胞LFs核蛋白,采用Western blot方法檢測p-c-Jun/c-Jun表達。 3、分別以ERK1/2、JNK1/2和p38特異性阻斷劑PD98059(10×10-6mol/L)、SP600125(10×10-6mol/L)和SB203580(10×10-6mol/L)作為干預方式,運用RT-PCR方法檢測早產(chǎn)鼠LFs高氧暴露12 h MMP-2、MT1-MMP、和TIMP-2 mRNA表達,采用明膠酶譜法檢測細胞總蛋白與培養(yǎng)上清混合液中MMP-2酶原及活酶表達和采用Western blot技術檢測p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、p-p38和p38蛋白表達。 4、取上述各組4 d早產(chǎn)鼠肺組織標本,采用TUNEL法檢測細胞凋亡,免疫組化法檢測PCNA表達, Western blot技術檢測p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、p-p38和p38表達水平。 5、取上述各組12 h AECII和LFs,采用流式細胞術(Annexin V—PI雙標記)檢測細胞凋亡,Western blot檢測AECII p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-p38、PCNA、P53及Caspase-3表達。 結果: 1、高氧、RA對早產(chǎn)鼠肺組織MMP-2、MMP-9、MT1-MMP、TIMP-1和TIMP-2表達的影響mRNA水平: 空氣暴露4 d、7 d、14 d時,早產(chǎn)大鼠肺組織MMP-2 mRNA的表達呈明顯下降趨勢;MMP-9和MT1-MMP mRNA的表達變化不明顯; TIMP-1 mRNA的表達呈升高趨勢,而TIMP-2 mRNA的表達則呈下降趨勢;RA對空氣暴露下MMP-2、MMP-9、MT1-MMP、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達均無明顯影響;與空氣組比較,高氧暴露后,MMP-2、MMP-9、MT1-MMP和TIMP-1 mRNA的表達均有不同程度升高;RA不同程度下調高氧暴露后MMP-2、MMP-9、MT1-MMP和TIMP-1 mRNA的表達;而高氧、RA對TIMP-2 mRNA的表達無明顯影響。 蛋白水平: 空氣暴露下,4 d、7 d、14 d時,MMP-2酶原和活酶的表達水平呈明顯下降趨勢;MMP-9酶原的表達在7 d、14 d時有所下降,而其活酶表達水平在14 d時才明顯下降;RA對空氣暴露下MMP-2和MMP-9酶原及其活酶的表達無明顯影響; 與空氣組比較,高氧暴露明顯提高了MMP-2活酶、MMP-9酶原及其活酶的表達,而對MMP-2酶原的表達無明顯影響;RA不同程度下調高氧暴露后MMP-2活酶、MMP-9酶原及其活酶的表達; 空氣暴露下,4 d、7 d、14 d時,TIMP-1蛋白表達水平呈升高趨勢;而TIMP-2的表達則無明顯變化;RA對空氣暴露下TIMP-1和TIMP-2表達無明顯影響;高氧暴露顯著提高TIMP-1的表達, RA則有進一步促進高氧暴露后TIMP-1蛋白表達升高趨勢;而高氧、RA對TIMP-2蛋白表達無明顯影響。 2、高氧、RA對早產(chǎn)鼠肺組織p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、p-p38、p38蛋白表達的影響 高氧暴露顯著提高p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38表達水平;RA不同程度降低高氧暴露下p-JNK1/2和p-p38表達,但進一步上調p-ERK1/2表達;高氧、RA對總ERK1/2、JNK1/2和p38表達無影響。 3、高氧、RA對早產(chǎn)鼠AECⅡ和LFs MMP-2、MT1-MMP和TIMP-2表達的影響 高氧暴露使LFs和AECⅡMMP-2、MT1-MMP mRNA表達明顯上調,RA則明顯下調高氧暴露下MMP-2和MT1-MMP mRNA表達;高氧、RA對TIMP-2 mRNA表達無明顯影響; 高氧暴露明顯增強LFs、AECⅡ細胞裂解蛋白和培養(yǎng)上清濃縮液混合物中MMP-2(LFs、AECⅡ)和MMP-9(AECⅡ)酶原及活酶表達,而RA則具有下調作用。 4、高氧、RA對早產(chǎn)鼠AECⅡ和LFs p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2、p-p38、p38蛋白表達的影響 高氧暴露顯著提高LFs和AECⅡp-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38表達水平;RA不同程度降低高氧暴露下p-JNK1/2和p-p38表達,但進一步上調p-ERK1/2表達;高氧、RA對總ERK1/2、JNK1/2和p38表達無影響。 5、高氧、RA對早產(chǎn)鼠LFs核蛋白p-c-Jun/c-Jun表達的影響高氧暴露顯著提高LFs p-c-Jun表達水平,RA則明顯下調高氧暴露下其表達。 6、高氧、RA、PD98059、SP600125、SB203580對早產(chǎn)鼠LFs MMP-2、MT1-MMP以及TIMP-2表達的影響 RA、SP600125、SB203580在下調p-JNK1/2和p-p38表達同時,LFs MMP-2和MT1-MMP mRNA表達也明顯下調,而TIMP-2 mRNA表達則不受影響; PD98059對LFs MMP-2、MT1-MMP和TIMP-2 mRNA表達無明顯影響。 7、高氧、RA對早產(chǎn)鼠肺組織細胞增殖、凋亡的影響高氧暴露4 d,肺實質凋亡細胞顯著增加,且以AECII、毛細血管內皮細胞和AECI為主;RA明顯降低高氧暴露下肺細胞凋亡; 高氧暴露4 d,PCNA陽性細胞指數(shù)明顯下降;RA明顯提高高氧暴露肺組織PCNA表達,同時高氧暴露使肺泡分隔第二嵴明顯減少、氣腔明顯增大;RA使空氣暴露早產(chǎn)鼠肺泡第二嵴明顯增多、肺泡直徑變小,而對高氧暴露動物氣腔大小以及第二嵴形成沒有明顯影響。 8、高氧、RA對原代培養(yǎng)早產(chǎn)鼠LFs和AECII增殖、凋亡的影響高氧暴露12 h, AECII以晚期凋亡和壞死為主,同時,與空氣組比較,其早期凋亡細胞數(shù)也顯著升高;RA明顯下調高氧暴露下AECII壞死、凋亡; 高氧暴露12 h,明顯降低AECII PCNA表達,顯著提高其P53和Caspase-3活性片段表達;RA則明顯上調AECII PCNA表達,下調P53和Caspase-3活性片段表達; 高氧、RA對LFs壞死、凋亡無明顯影響。 結論: 1、MMP-2、MMP-9、MT1-MMP、TIMP-1和TIMP-2動態(tài)表達變化規(guī)律與其在肺泡化過程中的作用密不可分; 2、高氧暴露明顯改變MMPs/TIMPs的表達,在肺泡形成關鍵時期,MMPs/TIMPs之間平衡關系的破壞是造成肺發(fā)育受阻和肺纖維化的重要因素; 3、高氧暴露激活MAPKs信號傳遞通路(主要是JNK1/2和p38)是導致MMPs/TIMPs表達失衡的重要原因; 4、高氧暴露,導致AECⅡ大量凋亡、壞死,增殖受到抑制;同時,LFs所受影響較小,兩種細胞對高氧暴露的差異性行為也是導致未成熟肺組織異常重構的重要原因; 5、RA通過下調JNK1/2和p38磷酸化水平、上調ERK1/2磷酸化水平,進而下調MMP-2、MMP-9、MT1-MMP表達與活化,降低AECⅡ壞死、凋亡,從而發(fā)揮高氧肺損傷保護作用。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R722
【圖文】：

圖 2-2-2 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測早產(chǎn)鼠AECⅡ、LFs mRNA 完整性 2-2-2A、B 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測早產(chǎn)鼠 AECⅡ mRNA 完整1 2 3 4 5 6 7 89 10 11 12 13 14 15 16

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本文編號：2727270