【摘要】： 支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早產(chǎn)兒最主要的死亡原因之一。存活的患兒則多殘留阻塞性氣道疾病,肺動(dòng)脈高壓以及嚴(yán)重的生長發(fā)育遲滯。盡管近20年來隨著早產(chǎn)兒重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)和肺表面活性物質(zhì)的運(yùn)用,早產(chǎn)兒存活率已顯著提高,但BPD的發(fā)生率卻有增無減。目前仍缺乏對(duì)BPD的根本性治療手段,探索其病理機(jī)制、尋找更好的治療手段一直是亟待解決的難題。目前研究認(rèn)為持續(xù)高體積分?jǐn)?shù)氧(高氧)吸入致肺損傷是BPD的明確病因之一,但其病理機(jī)制并不清楚。研究發(fā)現(xiàn)在BPD支氣管肺泡灌洗液或肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表達(dá)明顯升高,但目前缺乏系統(tǒng)的相關(guān)研究。慢病毒載體具有感染細(xì)胞種類廣泛,感染能力穩(wěn)定,表達(dá)時(shí)限長的優(yōu)勢(shì),而小分子干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)具有特異沉默目的基因的特點(diǎn)。我們用慢病毒介導(dǎo)的siRNA技術(shù),在新生昆明小鼠高氧吸入前直至吸入后一個(gè)月的肺組織發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期,活體內(nèi)持續(xù)抑制TGF-β1的高表達(dá),以研究其對(duì)新生小鼠持續(xù)高氧吸入所致肺損傷是否具有保護(hù)作用。 第一章靶向TGF-β1小分子干擾RNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定 目的以小分子干擾RNA技術(shù)構(gòu)建小鼠TGF-β1-shRNA慢病毒載體,并在肺泡二型上皮細(xì)胞(Alveolar epithelial cellsⅡ,AECⅡ)中行體外干擾效率鑒定。方法分別設(shè)計(jì)TGF-β1-shRNA干擾序列及陰性對(duì)照序列,BLAST驗(yàn)證基因同源性。設(shè)計(jì)的序列經(jīng)體外退火形成雙鏈寡核苷酸,將其與以BamH1/Xhol酶切后的載體pRNAT-u6.2連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,小量抽提質(zhì)粒后測(cè)序鑒定。得到的陽性質(zhì)粒以Xhol和Xbal雙酶切,回收其中7010bp條帶作為載體。載體PKG-RFP以Xhol和Nhel雙酶切,回收其中1262bp作為目的基因片段純化,以上兩片段連接重組,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,抽提質(zhì)粒。以BamH1單酶切鑒定,釋放出600bp條帶為正確的克隆質(zhì)粒,即為重組慢病毒載體。將慢病毒包裝系統(tǒng)三質(zhì)粒和重組慢病毒載體混合,導(dǎo)入293T細(xì)胞,包裝成病毒后,采集病毒上清液,采用系列梯度稀釋法,G418藥物篩選測(cè)定病毒滴度。同法構(gòu)建陰性干擾慢病毒載體。將包裝好的病毒轉(zhuǎn)染AECⅡ,分為干擾組,陰性干擾組和空白對(duì)照組3組,每組5復(fù)孔,干擾組和陰性干擾組分別加入構(gòu)建的干擾載體和陰性干擾載體,空白對(duì)照組加入等量不含病毒的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染96h后提取細(xì)胞蛋白質(zhì),以Western Blot檢驗(yàn)TGF-β1蛋白表達(dá)驗(yàn)證慢病毒載體干擾效率。并分別取3實(shí)驗(yàn)組AECⅡ細(xì)胞滴片,以TGF-β1多克隆抗體為一抗,FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗,間接免疫熒光法觀察TGF-β1表達(dá)情況。采集的數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析,多重比較用SNK法。結(jié)果測(cè)序結(jié)果顯示,TGF-β1-shRNA干擾序列成功插入pRNAT-u6.2載體,該重組質(zhì)粒與PKG-RFP載體重組、轉(zhuǎn)化、氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆,酶切驗(yàn)證質(zhì)粒重組成功。在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝,收集上清液,系列梯度稀釋法檢測(cè)病毒懸液的滴度,G418藥物篩選,測(cè)定慢病毒滴度為5.23×10~8TU/ml。Western Blot檢驗(yàn)TGF-β1蛋白表達(dá),干擾組明顯低于陰性干擾組(P＜0.05)和空白對(duì)照組(P＜0.05),抑制效率為73.6%。間接免疫熒光顯示陰性干擾組和空白對(duì)照組的熒光則呈較強(qiáng)表達(dá),而干擾組的綠色熒光表達(dá)則明顯減弱。結(jié)論成功構(gòu)建小鼠TGF-β1-shRNA慢病毒載體pU6.2-TGF-RFP-Lenti。其可有效抑制AECⅡTGF-β1蛋白的表達(dá)。關(guān)鍵詞轉(zhuǎn)化生長因子β1小分子干擾RNA慢病毒載體小鼠 第二章活體內(nèi)沉默TGF-β1基因?qū)π∈蠓闻莅l(fā)育的影響 目的:探討活體內(nèi)將慢病毒載體導(dǎo)入小鼠肺內(nèi)的方法和沉默肺TGF-β1基因?qū)π律∈笸砥诜闻莅l(fā)育的影響。方法:清潔級(jí)1日齡新生昆明小鼠75只,隨機(jī)分為干擾組,空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組3組,每組25只,于生后第3天(Postnataldays 3,以P3表示,下同)經(jīng)鼻內(nèi)吸入法將構(gòu)建好的TGF-β1-shRNA慢病毒載體導(dǎo)入干擾組新生小鼠肺內(nèi),將陰性對(duì)照慢病毒載體同法導(dǎo)入陰性對(duì)照組小鼠肺內(nèi),空白對(duì)照組不予干預(yù)。各組按小鼠生后4,7,14,21,28天分別殺取5只小鼠取肺組織。左肺制作冰凍切片于激光共聚焦顯微鏡下觀察肺組織紅色熒光蛋白R(shí)FP的表達(dá)情況。左肺制作石蠟切片于光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化,計(jì)算肺泡平均截距(Mean linear intercept,MLI)代表肺泡腔內(nèi)徑大小,計(jì)算放射狀肺泡計(jì)數(shù)(Radical alveolar counts,RAC)表示肺泡數(shù)目。取右肺采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測(cè)肺組織中TGFβ-1 mRNA表達(dá)水平。以Western Blot法檢測(cè)肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)水平。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SPSS13.0軟件行析因方差分析,多重比較用SNK法。結(jié)果:肺組織冰凍切片觀察,在P4～P28各觀察時(shí)間點(diǎn)均可見肺組織紅色熒光表達(dá);組織形態(tài)學(xué)觀察,在P4各組肺形態(tài)無明顯差別。干擾組P4 MLI和RAC與其他兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與其他兩組比較,干擾組P7～P28各時(shí)間點(diǎn)MLI明顯增大(P＜0.05),而RAC則明顯減少(P＜0.05),隨時(shí)間呈進(jìn)行性進(jìn)展(分別F=68.898,P=0.000;F=87.520,P=0.000)。干擾組TGF-β1 mRNA表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P＜0.05);TGF-β1蛋白表達(dá)水平在三組相比,P4時(shí)各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而P7～P28各時(shí)間點(diǎn)干擾組均明顯低于其他兩組(P＜0.05);在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比上述各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論:活體內(nèi)鼻內(nèi)吸入法可有效將慢病毒載體導(dǎo)入肺內(nèi),沉默新生小鼠肺組織TGF-β1表達(dá)可導(dǎo)致新生小鼠晚期肺泡發(fā)育過程阻滯。 第三章小鼠支氣管肺發(fā)育不良動(dòng)物模型的建立及其肺組織 TGF-β1、Smad 4的相關(guān)變化 目的:以高體積分?jǐn)?shù)氧吸入的方法制作小鼠支氣管肺發(fā)育不良模型,研究高氧新生小鼠肺組織結(jié)構(gòu)和TGF-β1、Smad4的變化情況。方法:清潔級(jí)1日齡新生昆明小鼠50只,于生后3天(Postnatal days 3,以P3表示,下同)隨機(jī)分為高氧組和對(duì)照組兩組,每組各25只。P4～P14將高氧組小鼠連同授乳母鼠一起置于自制氧箱內(nèi)飼養(yǎng)。維持氧箱內(nèi)氧氣體積分?jǐn)?shù)為600ml/L,以鈉石灰吸附CO_2,使其體積分?jǐn)?shù)低于5ml/L。供氧10天后恢復(fù)為空氣條件飼養(yǎng)�？諝饨M僅置空氣條件下飼養(yǎng);按P4,7,14,21,28每時(shí)間點(diǎn)各組分別殺取5只小鼠取肺組織,左肺制作石蠟切片,以HE染色法觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化,計(jì)算肺泡平均截距(Mean linear intercept,MLI)代表肺泡腔內(nèi)徑大小,計(jì)數(shù)放射狀肺泡計(jì)數(shù)(Radical alveolar counts,RAC)表示肺泡數(shù)目;制作超薄切片,透射電鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)變化;以兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗體為一抗,SABC免疫組織化學(xué)法觀察TGF-β1在肺組織的表達(dá)情況;取右肺以RT-PCR法檢測(cè)肺組織中TGFβ-1和Smad4 mRNA表達(dá)水平。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SPSS13.0行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果:對(duì)照組生后4天可見新生小鼠肺泡結(jié)構(gòu)不規(guī)則,肺泡數(shù)目較少,肺泡間隔較厚。P7開始對(duì)照組肺泡形態(tài)逐漸規(guī)整,間隔變薄,肺泡腔可見較多冠狀突起,肺泡數(shù)目增加。P14肺泡發(fā)育大小已較均一。P21～P28肺泡發(fā)育逐漸成熟,肺泡數(shù)目多,肺泡腔較小,肺泡間隔薄。P4高氧組與對(duì)照組肺形態(tài)無明顯差別,P7則可見高氧組肺泡腔和肺泡間隔炎性細(xì)胞滲出,肺泡間隔較厚,肺泡膈冠狀突起較少,肺泡腔輕度擴(kuò)大,P14～P21時(shí)肺泡腔進(jìn)一步擴(kuò)大并有融合,MLI明顯增大,而RAC則明顯減少,間質(zhì)增生伴有程度不等的纖維化。至P28可見肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂。在P7～P28,MLI和RAC兩組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);電鏡觀察高氧組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞腫脹,電子密度降低。胞質(zhì)內(nèi)板層小體較少或消失,結(jié)構(gòu)松散,有排空現(xiàn)象。線粒體腫脹,體積增大。微絨毛脫落,排列紊亂。毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯;免疫組化顯示對(duì)照組小鼠肺在P4～P28均有TGF-β1抗原陽性表達(dá),主要表達(dá)部位為支氣管上皮、血管內(nèi)皮和肺間質(zhì)。實(shí)驗(yàn)組在P7后表達(dá)較高氧組增強(qiáng)(P＜0.05),肺泡上皮細(xì)胞也見明顯陽性,特別是間質(zhì)表達(dá)明顯增強(qiáng);兩組P4時(shí)TGF-β1和Smad4 mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。高氧組P7～P28肺TGF-β1和Smad4 mRNA均較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。結(jié)論:成功建立新生小鼠高氧BPD模型。高氧吸入可導(dǎo)致肺組織TGF-β1和Smad4異常高表達(dá),TGF-β1/Smad通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上調(diào)是支氣管肺發(fā)育不良重要的病理機(jī)制之一。 第四章慢病毒介導(dǎo)TGF-β1 siRNA對(duì)新生小鼠高體積分?jǐn)?shù)氧吸入致肺損傷的保護(hù)作用 目的探討慢病毒介導(dǎo)的小分子干擾RNA技術(shù)抑制TGF-β1基因?qū)Ω唧w積分?jǐn)?shù)氧所致新生小鼠肺損傷是否具有保護(hù)作用。方法清潔級(jí)1日齡新生昆明小鼠100只,隨機(jī)分為高氧組,干擾組,陰性干擾組和空氣組4組,每組各25只,于生后3天(Postnatal days 3,以P3表示,下同)以鼻內(nèi)吸入法將構(gòu)建好的TGF-β1shRNA慢病毒載體及陰性對(duì)照載體分別導(dǎo)入干擾組和陰性干擾組小鼠肺內(nèi)。P4～P14天將高氧組、干擾組和陰性干擾組置于氧箱內(nèi)飼養(yǎng)。維持氧箱內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)為600ml/L,CO_2體積分?jǐn)?shù)低于5ml/L�？諝饨M不予任何干預(yù);按小鼠生后4,7,14,21,28天每時(shí)間點(diǎn)各組分別殺取5只動(dòng)物,左肺制作石蠟切片,HE染色觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化,計(jì)算肺泡平均截距(Mean linear intercept,MLI)代表肺泡腔內(nèi)徑大小,計(jì)算放射狀肺泡計(jì)數(shù)(Radical alveolar counts,RAC)表示肺泡數(shù)目;以SP-C和AQP5單克隆抗體為一抗,SABC免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織SP-C和AQP5表達(dá)情況;左肺制作冰凍切片,以FITC標(biāo)記的荊豆凝集素(Ulex europaeus agglutinin 1,UEA-1)孵育后激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)情況;取右肺采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerasechain reaction,RT-PCR)法檢測(cè)肺組織中TGF-β1和ColleganⅠmRNA表達(dá)水平;以Western Blot法檢測(cè)肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)水平。采集的數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行析因方差分析,多重比較用SNK法。結(jié)果P7后各時(shí)間點(diǎn),干擾組MLI低于高氧組(P＜0.05),高于空氣組(P＜0.05),而RAC則高于高氧組(P＜0.05),低于空氣組(P＜0.05);免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示空氣組AQP-5表達(dá)在P4～P28逐漸增強(qiáng)(F=614.440,P=0.000),高氧組在P7高于空氣組,后續(xù)時(shí)間點(diǎn)均較之明顯降低(P＜0.05)。干擾組AQP-5表達(dá)在P14-28高于高氧組(P＜0.05)但低于空氣組(P＜0.05);空氣組SP-C在P4～P14表達(dá)逐漸增強(qiáng),到P14有最強(qiáng)表達(dá),P21～P28表達(dá)下降(F=290.092,P=0.000)。高氧組SP-C表達(dá)在P7低于空氣組,而在P14～P21均較之增強(qiáng)(P＜0.05)。干擾組SP-C表達(dá)在P14～P21較高氧組為低(P＜0.05),但高于空氣組(P＜0.05)。在P28空氣組低于其他三組(P＜0.05),其余各組無顯著差別(P＞0.05);冰凍切片觀察UEA-1與肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后FITC的表達(dá)情況,可見P14和P28各組FITC在肺微血管均有表達(dá),空氣組沿支氣管和肺泡壁均見表達(dá)。高氧組和陰性干擾組則熒光表達(dá)增強(qiáng),排列迂曲紊亂。干擾組較之高氧組和陰性干擾組熒光表達(dá)減弱,熒光分布與肺泡結(jié)構(gòu)相一致;collagenⅠmRNA表達(dá)水平各組在P4～P7相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),干擾組P14后各時(shí)間點(diǎn)較高氧組和陰性干擾組為低(P＜0.05),但高于空氣組(P＜0.05);干擾組P4 TGF-β1 mRNA水平明顯低于其他各組(P＜0.05)。P7～P28干擾組低于高氧組和陰性對(duì)照組(P＜0.05),但高于空氣組(P＜0.05);P4各組TGF-β1蛋白表達(dá)水平無差異(P＞0.05)。干擾組在P7后各時(shí)間點(diǎn)均低于高氧組(P＜0.05),但高于空氣組(P＜0.05)。高氧組和陰性對(duì)照組相比,上述指標(biāo)在各時(shí)間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論慢病毒載體介導(dǎo)的TGF-β1小分子干擾RNA對(duì)高體積分?jǐn)?shù)氧吸入所致新生小鼠肺損傷有保護(hù)作用。抑制TGF-β1的異常高表達(dá)從而調(diào)節(jié)AECⅡ向AECⅠ的正常分化,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)正常降解,減輕肺微血管異常增殖并改善血管裝配是其可能的保護(hù)機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R722.6
【圖文】：

一ICP14盯P表達(dá)(x200)

一IAp4盯P表達(dá)(xZOO)

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2 陳

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