【摘要】：第一部分KIF3A在兒童哮喘中的表達(dá)及與氣道炎癥的相關(guān)性研究目的KIF3A基因與哮喘、特應(yīng)性皮炎、過敏性鼻炎等免疫系統(tǒng)疾病密切相關(guān),且KIF3A缺乏時可以加重哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)(Airway hyperresponsiveness,AHR)及促進(jìn)Th2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究擬探討KIF3A基因在兒童哮喘患者中表達(dá)水平及分析KIF3A表達(dá)水平與氣道炎癥的相關(guān)性。方法1.選取重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸中心住院的哮喘兒童(Asthma組,25例)及同期同年齡段體檢中心體檢的健康兒童作為研究對象(Normal組,25例),2組患兒空腹抽取靜脈血4ml及無菌毛刷取鼻腔粘膜細(xì)胞。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(q RT-PCR)法檢測2組兒童外周血細(xì)胞及鼻腔粘膜細(xì)胞中KIF3A m RNA的水平。2.選取25例哮喘急性發(fā)作期輕度兒童(Mild組)及25例哮喘急性發(fā)作期重度兒童(Severe組)作為研究對象,取其鼻腔粘膜細(xì)胞及外周血,q RT-PCR檢測外周血細(xì)胞及鼻腔粘膜細(xì)胞中KIF3A m RNA水平,同時檢測2組兒童血清IL-4、IL-5、IL-13及總Ig E水平,并分析KIF3A表達(dá)與血清IL-4、IL-5、IL-13及總Ig E水平相關(guān)性。結(jié)果1.外周血細(xì)胞中KIF3A表達(dá)情況,Asthma組KIF3A m RNA水平明顯低于Normal組(P0.05),鼻腔粘膜細(xì)胞中KIF3A m RNA水平Asthma組顯著低于Normal組(P0.05);2.Severe組兒童外周血細(xì)胞中KIF3A m RNA水平低于Mild組兒童,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),鼻腔粘膜細(xì)胞中KIF3A m RNA水平Severe組顯著低于Mild組(P0.05)。血清總Ig E及IL-4、IL-5、IL-13檢測結(jié)果顯示,Severe組明顯高于Mild組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);3.KIF3A與血清總Ig E、IL-4、IL-5、IL-13相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),KIF3A表達(dá)水平與IL-4、IL-5、IL-13及血清總I g E水平呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論1.KIF3A在哮喘兒童外周血及鼻腔粘膜細(xì)胞中表達(dá)下降;2.KIF3A在哮喘兒童中表達(dá)水平越低,哮喘兒童氣道炎癥越重。第二部分KIF3A基因與氣道炎癥及氣道上皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究目的通過第一部分的研究我們發(fā)現(xiàn)KIF3A基因在哮喘兒童中低表達(dá),且KIF3A表達(dá)水平與氣道炎癥密切相關(guān)。氣道炎癥及氣道上皮細(xì)胞異常凋亡在哮喘發(fā)病機(jī)制中起到非常重要的作用,且我們前面的研究已證實KIF3A在哮喘兒童中低表達(dá)。KIF3A低表達(dá)時還可以導(dǎo)致多種細(xì)胞凋亡,目前已研究發(fā)現(xiàn)的有感光細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等。那么KIF3A低表達(dá)時是否會導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞凋亡呢?因此,本研究將在第一部分研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討:1.通過人支氣管上皮細(xì)胞16HBE14o-研究KIF3A表達(dá)水平與氣道炎癥及氣道上皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)性;2.將BALB/C小鼠作為研究對象探討KIF3A表達(dá)水平與氣道炎癥及氣道上皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。方法1.體外實驗1)使用人支氣管上皮細(xì)胞16HBE 14o-作為實驗對象,實驗分組:a、正常對照組,僅用lipo2000處理;b、陰性對照組,轉(zhuǎn)染scramble-si RNA;c、si RNA1干擾組,轉(zhuǎn)染特異性靶向KIF3A的si RNA;d、si RNA2干擾組,轉(zhuǎn)染特異性靶向KIF3A的si RNA;e、Adv空載體對照組,用Adv空載體感染細(xì)胞株;f、KIF3A高表達(dá)組,用KIF3AAdv載體感染細(xì)胞株。2)WB檢測驗證各細(xì)胞分組構(gòu)建是否成功;3)用重組人IL-4、IL-13和TNF-α誘導(dǎo)處理實驗細(xì)胞后,Annexin V和PI雙染,流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡;4)q RT-PCR檢測各組細(xì)胞炎癥指標(biāo)CCL17、CCL26及IL-5、IL-8水平。2.體內(nèi)實驗1)將BALB/C小鼠作為研究對象,建立小鼠哮喘模型;2)模型建立后通過小鼠行為學(xué)表現(xiàn)、AHR檢測、血清總Ig E檢測、BALF中炎癥細(xì)胞計數(shù)及肺組織HE染色驗證BALB/C哮喘小鼠模型是否建立成功;3)使用攜帶KIF3A基因的Adv載體轉(zhuǎn)染哮喘小鼠構(gòu)建KIF3A高表達(dá)組(OVA+KIF3A組),利用Adv空載體轉(zhuǎn)染哮喘小鼠作為KIF3A基因低表達(dá)組(OVA組)及正常小鼠轉(zhuǎn)染Adv空載體作為對照(Normal組);4)q RT-PCR及WB檢測3組小鼠氣道上皮中KIF3A表達(dá),TUNEL檢測氣道上皮細(xì)胞凋亡,q RT-PCR及ELISA檢測3組小鼠肺組織中及BALF中相關(guān)炎癥因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α水平;5)分析KIF3A表達(dá)與氣道炎癥因子和氣道上皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。結(jié)果1.體外實驗:1)細(xì)胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)KIF3A低表達(dá)后細(xì)胞凋亡明顯增加,而KIF3A表達(dá)增高后可以顯著減少細(xì)胞凋亡的數(shù)量(P0.05);2)q RT-PCR結(jié)果顯示,KIF3A低表達(dá)時炎癥指標(biāo)CCL17、CCL26、IL-5及IL-8明顯增高,而KIF3A表達(dá)增高后CCL17、CCL26、IL-5及IL-8水平顯著下降(P0.05)。2.體內(nèi)實驗:1)q RT-PCR及WB檢測結(jié)果顯示,3組小鼠KIF3A差異表達(dá)構(gòu)建成功(P0.05);2)TENUL檢測發(fā)現(xiàn),KIF3A低表達(dá)后細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多,KIF3A表達(dá)增高后可減少細(xì)胞凋亡數(shù)量(P0.05);3)3組小鼠肺組織及BALF中相關(guān)炎癥因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、IL-8、TNF-α檢測結(jié)果顯示KIF3A低表達(dá)時炎癥因子水平明顯增高,KIF3A表達(dá)增高后可顯著降低炎癥因子水平(P0.05);4)KIF3A表達(dá)與細(xì)胞凋亡相關(guān)性分析顯示,KIF3A表達(dá)越低細(xì)胞凋亡越明顯;5)KIF3A表達(dá)與炎癥因子相關(guān)性分析顯示,KIF3A表達(dá)水平與炎癥因子IL-4、IL-5、IL-13及血清總Ig E水平呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論KIF3A基因在哮喘中低表達(dá),且KIF3A表達(dá)水平與哮喘氣道炎癥及氣道上皮細(xì)胞凋亡密切相關(guān),KIF3A表達(dá)水平越低,氣道炎癥越重且氣道上皮細(xì)胞凋亡越明顯。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R725.6
【圖文】：

-1 qRT-PCR 檢測外周血細(xì)胞中 KIF3A RNA in blood cells was detected by qR2 qRT-PCR 檢測鼻腔粘膜細(xì)胞中 KIF3AA in nasal mucosal cells was detected b

qRT-PCR檢測鼻腔粘膜細(xì)胞中KIF3AmRNAFig1-2KIF3AmRNAinnasalmucosalcellswasdetectedbyqRT-PCR.(*P<0.05)

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