【摘要】：第一部分KIF3A在兒童哮喘中的表達及與氣道炎癥的相關性研究目的KIF3A基因與哮喘、特應性皮炎、過敏性鼻炎等免疫系統(tǒng)疾病密切相關,且KIF3A缺乏時可以加重哮喘小鼠的氣道高反應(Airway hyperresponsiveness,AHR)及促進Th2介導的炎癥反應。本研究擬探討KIF3A基因在兒童哮喘患者中表達水平及分析KIF3A表達水平與氣道炎癥的相關性。方法1.選取重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院呼吸中心住院的哮喘兒童(Asthma組,25例)及同期同年齡段體檢中心體檢的健康兒童作為研究對象(Normal組,25例),2組患兒空腹抽取靜脈血4ml及無菌毛刷取鼻腔粘膜細胞。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(q RT-PCR)法檢測2組兒童外周血細胞及鼻腔粘膜細胞中KIF3A m RNA的水平。2.選取25例哮喘急性發(fā)作期輕度兒童(Mild組)及25例哮喘急性發(fā)作期重度兒童(Severe組)作為研究對象,取其鼻腔粘膜細胞及外周血,q RT-PCR檢測外周血細胞及鼻腔粘膜細胞中KIF3A m RNA水平,同時檢測2組兒童血清IL-4、IL-5、IL-13及總Ig E水平,并分析KIF3A表達與血清IL-4、IL-5、IL-13及總Ig E水平相關性。結(jié)果1.外周血細胞中KIF3A表達情況,Asthma組KIF3A m RNA水平明顯低于Normal組(P0.05),鼻腔粘膜細胞中KIF3A m RNA水平Asthma組顯著低于Normal組(P0.05);2.Severe組兒童外周血細胞中KIF3A m RNA水平低于Mild組兒童,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),鼻腔粘膜細胞中KIF3A m RNA水平Severe組顯著低于Mild組(P0.05)。血清總Ig E及IL-4、IL-5、IL-13檢測結(jié)果顯示,Severe組明顯高于Mild組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);3.KIF3A與血清總Ig E、IL-4、IL-5、IL-13相關性分析發(fā)現(xiàn),KIF3A表達水平與IL-4、IL-5、IL-13及血清總I g E水平呈負相關。結(jié)論1.KIF3A在哮喘兒童外周血及鼻腔粘膜細胞中表達下降;2.KIF3A在哮喘兒童中表達水平越低,哮喘兒童氣道炎癥越重。第二部分KIF3A基因與氣道炎癥及氣道上皮細胞凋亡的相關性研究目的通過第一部分的研究我們發(fā)現(xiàn)KIF3A基因在哮喘兒童中低表達,且KIF3A表達水平與氣道炎癥密切相關。氣道炎癥及氣道上皮細胞異常凋亡在哮喘發(fā)病機制中起到非常重要的作用,且我們前面的研究已證實KIF3A在哮喘兒童中低表達。KIF3A低表達時還可以導致多種細胞凋亡,目前已研究發(fā)現(xiàn)的有感光細胞、腎小管上皮細胞等。那么KIF3A低表達時是否會導致氣道上皮細胞凋亡呢?因此,本研究將在第一部分研究的基礎上進一步探討:1.通過人支氣管上皮細胞16HBE14o-研究KIF3A表達水平與氣道炎癥及氣道上皮細胞凋亡的相關性;2.將BALB/C小鼠作為研究對象探討KIF3A表達水平與氣道炎癥及氣道上皮細胞凋亡的相關性。方法1.體外實驗1)使用人支氣管上皮細胞16HBE 14o-作為實驗對象,實驗分組:a、正常對照組,僅用lipo2000處理;b、陰性對照組,轉(zhuǎn)染scramble-si RNA;c、si RNA1干擾組,轉(zhuǎn)染特異性靶向KIF3A的si RNA;d、si RNA2干擾組,轉(zhuǎn)染特異性靶向KIF3A的si RNA;e、Adv空載體對照組,用Adv空載體感染細胞株;f、KIF3A高表達組,用KIF3AAdv載體感染細胞株。2)WB檢測驗證各細胞分組構(gòu)建是否成功;3)用重組人IL-4、IL-13和TNF-α誘導處理實驗細胞后,Annexin V和PI雙染,流式細胞儀測定細胞凋亡;4)q RT-PCR檢測各組細胞炎癥指標CCL17、CCL26及IL-5、IL-8水平。2.體內(nèi)實驗1)將BALB/C小鼠作為研究對象,建立小鼠哮喘模型;2)模型建立后通過小鼠行為學表現(xiàn)、AHR檢測、血清總Ig E檢測、BALF中炎癥細胞計數(shù)及肺組織HE染色驗證BALB/C哮喘小鼠模型是否建立成功;3)使用攜帶KIF3A基因的Adv載體轉(zhuǎn)染哮喘小鼠構(gòu)建KIF3A高表達組(OVA+KIF3A組),利用Adv空載體轉(zhuǎn)染哮喘小鼠作為KIF3A基因低表達組(OVA組)及正常小鼠轉(zhuǎn)染Adv空載體作為對照(Normal組);4)q RT-PCR及WB檢測3組小鼠氣道上皮中KIF3A表達,TUNEL檢測氣道上皮細胞凋亡,q RT-PCR及ELISA檢測3組小鼠肺組織中及BALF中相關炎癥因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α水平;5)分析KIF3A表達與氣道炎癥因子和氣道上皮細胞凋亡的相關性。結(jié)果1.體外實驗:1)細胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)KIF3A低表達后細胞凋亡明顯增加,而KIF3A表達增高后可以顯著減少細胞凋亡的數(shù)量(P0.05);2)q RT-PCR結(jié)果顯示,KIF3A低表達時炎癥指標CCL17、CCL26、IL-5及IL-8明顯增高,而KIF3A表達增高后CCL17、CCL26、IL-5及IL-8水平顯著下降(P0.05)。2.體內(nèi)實驗:1)q RT-PCR及WB檢測結(jié)果顯示,3組小鼠KIF3A差異表達構(gòu)建成功(P0.05);2)TENUL檢測發(fā)現(xiàn),KIF3A低表達后細胞凋亡數(shù)量明顯增多,KIF3A表達增高后可減少細胞凋亡數(shù)量(P0.05);3)3組小鼠肺組織及BALF中相關炎癥因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-6、IL-8、TNF-α檢測結(jié)果顯示KIF3A低表達時炎癥因子水平明顯增高,KIF3A表達增高后可顯著降低炎癥因子水平(P0.05);4)KIF3A表達與細胞凋亡相關性分析顯示,KIF3A表達越低細胞凋亡越明顯;5)KIF3A表達與炎癥因子相關性分析顯示,KIF3A表達水平與炎癥因子IL-4、IL-5、IL-13及血清總Ig E水平呈負相關。結(jié)論KIF3A基因在哮喘中低表達,且KIF3A表達水平與哮喘氣道炎癥及氣道上皮細胞凋亡密切相關,KIF3A表達水平越低,氣道炎癥越重且氣道上皮細胞凋亡越明顯。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R725.6
【圖文】：

-1 qRT-PCR 檢測外周血細胞中 KIF3A RNA in blood cells was detected by qR2 qRT-PCR 檢測鼻腔粘膜細胞中 KIF3AA in nasal mucosal cells was detected b

qRT-PCR檢測鼻腔粘膜細胞中KIF3AmRNAFig1-2KIF3AmRNAinnasalmucosalcellswasdetectedbyqRT-PCR.(*P<0.05)

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本文編號：2724875