【摘要】：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥是最常見的人類酶缺陷病之一,全世界范圍內(nèi)約有4億人受累,目前認(rèn)為發(fā)病率較高的原因是由于瘧疾選擇的結(jié)果。因此該病主要分布于瘧疾高發(fā)的熱帶亞熱帶地區(qū),從非洲熱帶、中東、東南亞到中國南方地區(qū)、南美洲某些地區(qū)、亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)、地中海某些地區(qū)、巴布亞-新幾內(nèi)亞,而新加坡、夏威夷等因移民原因也成為高發(fā)地區(qū)。G6PD缺乏癥屬X連鎖不完全顯性遺傳,G6PD基因定位于Xq28,全長約20kb,含有13個外顯子和12個內(nèi)含子,編碼515個氨基酸。G6PD缺乏癥的分子基礎(chǔ)為G6PD基因的突變導(dǎo)致生化表型的改變并產(chǎn)生臨床癥狀。目前全世界已報道了160多種G6PD基因突變型,大部分是單堿基改變的錯義突變�；颊咧心行园牒献覩6PD活性顯著缺乏,女性雜合子酶活性變異范圍較大,可顯著性降低,也可在正常范圍內(nèi)。G6PD缺乏癥最常見的臨床表現(xiàn)是新生兒黃疸和急性溶血性貧血,前者可以導(dǎo)致新生兒核黃疸,從而影響新生兒智力。 G6PD缺乏癥在我國主要分布在長江以南省份,廣東、廣西、海南、貴州、云南、四川、臺灣等省份,人群中基因攜帶率約為4～20%,男性發(fā)病率高于女性。目前臨床上檢測G6PD活性方法主要是酶活性檢測方法,由于女性雜合子酶活性變異程度較大,該方法常常造成女性雜合子的漏檢。本研究試圖建立一種準(zhǔn)確、經(jīng)濟且適用于檢測中國人的常見G6PD基因突變技術(shù)體系。此外,本研究還探討了G6PD缺乏癥與新生兒高膽紅素血癥之間的相關(guān)性,研究結(jié)果將對G6PD缺乏癥的診斷以及新生兒高膽紅素血癥的預(yù)防提供新的診斷方法與有價值的遺傳學(xué)資料。 一、反向點雜交檢測中國人常見G6PD點突變方法的研究 G6PD缺乏癥為X連鎖不完全顯性遺傳,根據(jù)萊昂假說,女性雜合子兩條X染色體會隨機失活一條,所以女性雜合子酶活性有較大的變異度。目前臨床上檢測G6PD主要是檢測酶活性的生化檢測法,所以會漏檢表型較輕微的女性雜合子,這部分雜合子患者雖然表型輕微,但依然有可能生出一個患病的男孩,而只有分子診斷才能夠準(zhǔn)確的檢測這部分患者,然而,目前存在的G6PD分予診斷方法存在各種各樣的問題,難以推廣使用。因此,臨床上迫切需要一種準(zhǔn)確、經(jīng)濟、且能同時檢測中國人常見G6PD突變的檢測方法。 中國人G6PD突變譜現(xiàn)已有25種,但占突變構(gòu)成比絕大部分的是少數(shù)常見突變類型。本研究將多重PCR與反向點雜交技術(shù)結(jié)合在一起,建立了一種準(zhǔn)確、經(jīng)濟,能同時檢測中國人G6PD 7種突變的方法。這7種突變類型分別是:c.95A＞G,c.871G＞A,c.1004C＞T,c.1024C＞T,c.1311C＞T,c.1376G＞T和c.1388G＞A,合計占整個突變構(gòu)成比的85%左右。其基本原理和主要實驗步驟如下:反向點雜交技術(shù)檢測點突變的基本原理是通過位于寡核苷酸探針中部的序列特異性堿基與靶序列DNA的堿基配對和嚴(yán)格條件下洗膜來達(dá)到檢測基因中少數(shù)堿基變化的目的,探針5'端標(biāo)記有氨基臂(-NH2),與尼龍膜表面的羧基(-COOH)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而共價穩(wěn)定結(jié)合。引物5'端標(biāo)記了生物素,PCR產(chǎn)物擴增后,產(chǎn)物片段末端即標(biāo)有生物素,與探針雜交后,用酶標(biāo)結(jié)合蛋白及其酶的底物即可獲得特異性雜交斑點信號(顏色反應(yīng)),根據(jù)顯色探針的類型可知所分析標(biāo)本的基因型。首先,針對G6PD基因和7個突變點設(shè)計三對特異性PCR擴增引物和14條特異性探針;然后,優(yōu)化多重PCR體系以及反向點雜交體系;最后,確定最終反應(yīng)條件和引物及探針序列。多重PCR引物設(shè)計時,盡量使6條引物的Tm值接近以使其復(fù)性效率相近從而達(dá)到在同一體系中擴增的目的。探針設(shè)計時,不但要使探針Tm值接近,還要盡量使突變位點位于探針序列中部,以達(dá)到最大的特異性效果。第一步,PCR擴增獲得含有7個突變位點的三個G6PD基因片段。第二步,將PCR擴增的產(chǎn)物加入10ml聚丙烯離心管中,管內(nèi)有10ml的2×SSC-0.1%SDS雜交緩沖液和制備好的膜條,100℃沸水浴變性10分鐘,然后置恒溫水浴雜交儀中43.5℃雜交過夜。第三步,雜交完全后將膜條轉(zhuǎn)移至另一離心管中(含10ml已預(yù)熱的0.5×SSC-0.1%SDS洗滌緩沖液),于43.5℃洗膜10分鐘,之后又將膜條轉(zhuǎn)移至另一離心管中(含10ml的2×SSC-0.1%SDS緩沖液),并加入5μl酶標(biāo)抗生物素鏈菌素蛋白,在室溫下顛倒振搖15分鐘,取出膜條并用2×SSC-0.1%SDS緩沖液洗膜2次(每次各5分鐘)后浸入顯色液中避光顯色10分鐘。顯色液臨用時配制,20ml顯色液含0.1mg/ml TMB、2μl的30%H_2O_2、0.1M檸檬酸鈉(pH5.0)。陽性結(jié)果判定為出現(xiàn)藍(lán)紫色斑點。對于單個患者來說,若相對應(yīng)的突變位點與野生型位點探針均顯色,則為雜合子患者;若只是突變探針顯色,而相應(yīng)的野生型探針不顯色,則為女性純合子或男性半合子,若其相對應(yīng)的兩個突變探針和野生型探針均顯色,則為雙重雜合子患者。 為了評價該方法的特異性,我們選擇了209例樣品(已用直接測序的方法確定了基因型)對該方法進(jìn)行雙盲實驗測試。結(jié)果除兩例突變類型不在我們待檢測突變里的樣品不能檢測以外,其余樣品所檢測的結(jié)果與測序結(jié)果完全相符,證明多重PCR結(jié)合反向點雜交技術(shù)能對G6PD這7種常見突變的各種基因型組合準(zhǔn)確分型。 二、G6PD缺乏癥與新生兒高膽紅素血癥相關(guān)性研究 G6PD缺乏癥最嚴(yán)重的后果之一為新生兒高膽紅素血癥以及進(jìn)一步導(dǎo)致的新生兒核黃疸。G6PD缺乏癥可以導(dǎo)致新生兒黃疸很早就已經(jīng)被證實,認(rèn)為是G6PD活性缺乏導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞增多增加了膽紅素的生成所致,但后來發(fā)現(xiàn)很多G6PD缺乏合并新生兒黃疸的個體并沒有很明顯的溶血發(fā)生,這種現(xiàn)象的原因被認(rèn)為是G6PD活性缺乏導(dǎo)致溶血增加合并膽紅素在肝內(nèi)結(jié)合能力的下降協(xié)同作用所致。隨后人們發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)與膽紅素結(jié)合的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)基因啟動子區(qū)突變導(dǎo)致酶活性的降低可以進(jìn)一步增加G6PD活性缺乏新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的機率證實了上一觀點。由此,我們認(rèn)為膽紅素排泄路徑上相關(guān)酶和蛋白的SNPs會影響酶和蛋白的功能,從而與G6PD活性缺乏協(xié)同作用增加新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的機率。膽紅素的排泄途徑主要分為三步:未結(jié)合膽紅素由肝細(xì)胞膜上的有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽C(OATP-C)轉(zhuǎn)運至肝細(xì)胞內(nèi),在肝細(xì)胞內(nèi)的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)的催化作用下與葡萄糖醛酸結(jié)合形成結(jié)合膽紅素,結(jié)合膽紅素通過多藥耐受相關(guān)蛋白2(MRP2)轉(zhuǎn)運到膽管。 本研究選擇了UGT1A1基因,OATP-C基因和MRP2基因中外顯子和啟動區(qū)中國人頻率大于5%的SNPs以及有文獻(xiàn)報道的影響三個基因功能且中國人頻率大于5%的SNPs列為待分析SNPs。由此,UGT1A1基因-3279T＞G,(TA)._6TAA-(TA)_7TAA和211G＞A,OATP-C基因-11187G＞A,388A＞G,521T＞C,MRP2基因-24C＞T和1249G＞A 8個SNPs位點被列為待分析SNPs位點。我們應(yīng)用變性高效液相色譜(DHPLC)對這8個SNPs進(jìn)行基因分型,應(yīng)用PHASE2.1.1軟件對各個基因單倍型進(jìn)行構(gòu)建。本研究設(shè)計了病例—對照研究方案,在研究中,病例組為150例G6PD缺乏的新生兒,對照組為178例G6PD正常的新生兒,所有標(biāo)本中,有其它因素影響新生兒膽紅素水平的病例要被排除,包括早產(chǎn)兒、出生后存在窒息、敗血癥患者、乙肝大三陽患者、膽管阻塞者、ABO和Rh血型不合導(dǎo)致的溶血、攜帶其它血紅蛋白病(如地中海貧血)、嚴(yán)重脫水、嚴(yán)重血管外溶血(如頭顱血腫、皮下血腫、肺等部位大出血)、極低體重出生兒、血清膽紅素和皮測膽紅素值均未測定者、出生7天以后才入院的病例。本研究測量新生兒出生后1至7天每天的血清總膽紅素值,把最高的值定為峰值。根據(jù)析因設(shè)計的方差分析法分別分析病例組與對照組各個SNPs位點和各個基因單倍型與膽紅素峰值的相關(guān)性,從而找出對血清總膽紅素有顯著影響的SNPs或單倍型。 實驗結(jié)果中,G6PD缺乏組血清總膽紅素峰值水平在各個SNPs的分析中均顯著高于G6PD正常組,證實G6PD缺乏確實為新生兒血清膽紅素水平的重要影響因素。8個SNPs位點的分析中,UGT1A1 211GG基因型組總膽紅素水平為235.12±89.18μmol/L,UGT1A1 211GA/AA基因型組總膽紅素水平為272.10±106.70μmol/L,突變組血清總膽紅素水平顯著的高于正常組(F=11.600,P=0.001);OATP-C -11187GG基因型組總膽紅素水平為238.76±93.04μmol/L,OATP-C-11187GA/AA基因型組總膽紅素水平為270.40±102.46μmol/L,突變組血清總膽紅素水平顯著的高于正常組(F=8.229,P=0.004),證實攜帶UGT1A1 211 G＞A和OATP-C-11187 G＞A突變?yōu)樾律鷥焊吣懠t素血癥發(fā)生的重要風(fēng)險因素。其余6個SNPs對新生兒血清總膽紅素濃度峰值均無顯著性差異。在單倍型的分析中,UGT1A1基因的不同雙倍型之間和OATP-C基因的不同雙倍型之間新生兒血清總膽紅素濃度峰值均有顯著性差異,MRP2基因的不同雙倍型之間新生兒血清總膽紅素濃度峰值無顯著性差異。我們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),UGT1A1基因的雙倍型和OATP-C基因的雙倍型與新生兒膽紅素濃度峰值相關(guān)實際上是UGT1A1 211G＞A和OATP-C-11187G＞A對新生兒血清膽紅素濃度峰值影響的間接體現(xiàn),直接分析相關(guān)SNPs對新生兒血清總膽紅素水平的影響會比分析單倍型對新生兒血清總膽紅素的影響更為直接明了。 我們認(rèn)為G6PD活性缺乏、UGT1A1 211 G＞A突變和OATP-C-11187 G＞A突變?yōu)樾律鷥焊吣懠t素血癥發(fā)生的三個重要影響因素,且三個因素對新生兒總膽紅素濃度具有累積效應(yīng),即攜帶這三個因素數(shù)量越多,發(fā)生新生兒高膽紅素血癥的可能性越大,攜帶三個風(fēng)險因素個體的優(yōu)勢比為不攜帶任何風(fēng)險因素的個體7.233(95%CI:1.416-36.948)倍。 三、結(jié)論 本研究建立基于多重PCR和反向點雜交技術(shù)的能同時檢測7種中國人常見G6PD突變的方法,該方法不需要昂貴的設(shè)備與嚴(yán)格的技術(shù)條件,具有準(zhǔn)確、低成本等特點,適用于G6PD缺乏癥臨床診斷的輔助診斷,也可以滿足科研研究中對G6PD進(jìn)行基因分型的需要,尤其適合在欠發(fā)達(dá)地區(qū)的推廣使用。此外,本研究探討了G6PD缺乏與新生兒高膽紅素血癥之間的關(guān)系,得到了膽紅素代謝轉(zhuǎn)運通路上的兩個SNPs與新生兒高膽紅素血癥密切相關(guān),該研究可以為臨床上G6PD缺乏新生兒以及G6PD正常的新生兒黃疸的預(yù)防做一個參考,使易發(fā)生黃疸的人群得到更多的關(guān)注,最大程度上減少新生兒核黃疸的發(fā)生。 總之,本研究深入探討了中國人G6PD缺乏癥的分子診斷方法的建立及其嚴(yán)重后果—新生兒黃疸的遺傳基礎(chǔ)及相關(guān)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。我們希望以此為基礎(chǔ),提出具體的實施方案,通過預(yù)測個體新生兒高膽紅素血癥發(fā)生可能性,避免臨床上新生兒高膽紅素血癥預(yù)防的盲目性,從而更大程度上降低醫(yī)療費用,減少醫(yī)生精力的分散。該研究將減少新生兒核黃疸悲劇的發(fā)生,從而提高我國出生人口的素質(zhì)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R722.1

【引證文獻(xiàn)】

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1 王君;李明霞;;新生兒高膽紅素血癥病因相關(guān)基因研究進(jìn)展[J];中國新生兒科雜志;2013年04期

本文編號：2718427