【摘要】： 研究目的: 通過建立新生大鼠高氧肺損傷模型并分析測定不同時期肺損傷的肺組織中CCAAT增強子結合蛋白(C/EBPα)基因及其蛋白產物表達水平的變化,從而探討C/EBPα在新生大鼠高氧性肺損傷發(fā)病機制中的地位及作用,為今后的臨床預防和治療提供新的作用靶點。 研究方法: 選取80只出生6小時內的清潔級Sprague-Dawley(S-D)新生大鼠(簡稱新生大鼠)作為研究對象,按實驗設計采用以下研究方法: 1.實驗分組:將上述新生大鼠根據實驗條件隨機分為2組:Ⅰ、空氣對照組,Ⅱ、高氧暴露組,每組40只。Ⅰ組置于正�？諝猸h(huán)境中與母鼠共同喂養(yǎng),Ⅱ組置于專用高氧箱中喂養(yǎng); 2.高氧肺損傷模型的建立:高氧暴露組新生大鼠置90-95%氧濃度環(huán)境的高氧箱中喂養(yǎng),按照高氧暴露后12h末、1d、3d、7d、14d,5個時間點分5個亞組,每個亞組8只,各時間點處死動物; 3.組織學觀測:取左肺予常規(guī)組織學方法制作標本切片,HE染色后鏡下觀察肺臟形態(tài)結構變化并檢測肺組織輻射狀肺泡計數(RAC),并與對照組大鼠比較; 4.糖原染色:取標本切片以過碘酸雪夫氏染色法(PAS染色法)處理,鏡下觀測并評估組織中糖原含量,并與對照組比較; 5. C/EBPαmRNA的表達及其蛋白產物的檢測:取右肺標本制肺組織均漿,RT-PCR測定肺組織均漿中C/EBPαmRNA的變化;免疫組織化學結合顯微圖像分析檢測C/EBPα基因蛋白的表達,并分別與對照組比較。 研究結果: 1.高氧性肺損傷組織學變化:與空氣對照組相比,實驗組新生大鼠高氧暴露12h, 1天后肺組織結構未見明顯變化,3天后見肺毛細血管擴張、肺泡充血及少量出血、炎性細胞浸潤等病理變化;7d后肺損傷表現進一步加重,表現為大面積肺組織出血、水腫、炎性細胞浸潤明顯;14天肺泡腔炎性滲出不明顯,肺泡數量減少,肺間隔明顯增厚,肺間質細胞增加,肺組織結構紊亂,形成結構簡單的肺泡; 2.肺組織輻射狀肺泡計數(RAC):與空氣組新生大鼠比較,高氧暴露后3d內RAC雖有減少但無顯著性差異(P0.05);此后隨著日齡兩組間RAC差異逐漸增大,至高氧暴露7d后,實驗組新生大鼠RAC計數明顯低于相應空氣組,差異有顯著性意義(P0.05),14d高氧組與相應空氣組RAC比較減少更為明顯,兩者間差異有高度顯著性意義(P0.01); 3.肺組織中糖原含量的比較:與空氣組新生大鼠比較,高氧暴露12小時及1天時糖原含量有所下降,但兩組比較無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),3天及7天后肺組織上皮細胞中糖原含量下降明顯,兩組間差異有顯著性意義(P0.05,P0.01),而高氧暴露14天后糖原含量明顯增加,兩組比較差異有顯著性意義(P0.01); 4. mRNA及蛋白產物的表達:RT-PCR及免疫組織化學檢測檢測結果均表明:空氣對照組新生大鼠肺組織中C/EBPα的表達在生后12小時達峰值,此后隨著時間的推移,C/EBPα的表達逐漸下降。高氧組新生大鼠肺組織中C/EBPα表達情況則呈現先升高后下降的趨勢,即在出生后12小時比空氣組表達水平略高,但兩組間無顯著性差異(P0.05);1天后兩者間差異進一步加大且有顯著性意義(P0.05),至實驗3天后高氧組新生大鼠肺組織中C/EBPα的表達達到高峰,較空氣組明顯升高,差異有高度顯著性意義(P0.01);隨后開始下降,第7天時與空氣組比較無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),第14天時,較空氣組明顯下降,兩組間差異有顯著性意義(P0.01); 結論: 1.本實驗成功建立了新生大鼠高氧肺損傷的病理模型,隨著高氧暴露時間的延長,肺組織的損傷程度進行性加重,至高氧暴露14天時,出現了類似于支氣管肺發(fā)育不良的表現; 2. C/EBPα主要表達于肺泡Ⅱ型上皮細胞及終末細支氣管上皮細胞中,在正常對照組生后C/EBPα表達呈現逐漸遞減的趨勢,提示生后C/EBPα的調控可能與正常肺發(fā)育關系密切; 3. C/EBPαmRNA及蛋白表達在高氧肺損傷的早期有高表達,晚期表達下降,表明轉錄因子C/EBPα可能參與高氧肺損傷應激初期肺組織的保護性調節(jié)機制,但隨著損傷程度的加重,這種保護性機制將出現失衡,晚期表達下降可能是導致肺泡發(fā)育受阻,成熟障礙的重要因素; 4.隨著高氧暴露時間的延長,肺泡上皮細胞內的糖原含量呈現先減少后增多的趨勢,其糖原含量減少可能與C/EBPα的保護性調節(jié)機制及肺損傷時糖原過度消耗有關,后期糖原含量明顯增加則提示高氧肺損傷晚期存在肺泡Ⅱ型細胞分化成熟障礙。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R722.1
【圖文】：

圖 4 空氣組 C/EBPα mRNA 條帶 圖 5 高氧組 C/EBPα mRNA 條帶表 4 兩組肺組織 C/EBPα mRNA 表達的比較時間點組別 12h 1d 3d 7d 14d F 值 P 值高氧組 0.92±0.12 0.96±0.06 1.02±0.03 0.76±0.03 0.38±0.04 42.32 <0.01空氣組 0.89±0.09 0.82±0.07 0.77±0.16 0.72±0.16 0.71±0.02 2.01 <0.05P 值 P>0.05 P<0.05 P<0.01 P>0.05 P<0.01兩組肺組織C/EBPα mRNA表達比較0.801.001.20高氧組空氣組

述 CCAAT 增強子結合蛋白α在高氧肺損傷新生大鼠肺組織中的動態(tài)表達及其式調控作用有三個必需的功能域：a 穩(wěn)定功能域(SR)，位于 C/EBPs 的 N 端，到穩(wěn)定 C/EB 蛋白結構的作用；b DNA 結合功能域(DBD)，位于 C/EBP 的 C 端亮氨酸拉鏈區(qū)(Lz)和堿性氨基酸區(qū)(BR)兩個 C/EBP 異構體的 Lz 區(qū)通過螺旋的作用形成 C/EBPs 的同源或異源二聚體，然后成對的 BR 區(qū)結合在 DNA 上具有保守結構的蛋白質又稱為bZI蛋白；c 激活功能域(AD)位于DBD區(qū)和SR區(qū)之趣的是，C/EBP 包含兩個功能上可相互促進但不相互依賴的激活功能域 AD1D2，且 ADl 的激活功能強于 AD2。成員的基本結構區(qū)域是強大的正電荷區(qū)域，與 DNA 直接相互作用。

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本文編號：2717230