【摘要】： 前言 早產(chǎn)兒慢性肺疾病(chroniclungdisease,CLD)是早產(chǎn)兒長時間吸入高濃度氧或機械通氣治療或感染后最常見的和最嚴重的并發(fā)癥。早產(chǎn)兒CLD作為早產(chǎn)兒肺透明膜病治療的并發(fā)癥在1967年首次被Northway描述,也稱為支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)。氧療法是患有心肺疾病的早產(chǎn)兒最常應(yīng)用的一種治療手段。這一措施雖可改變患兒的低血氧狀態(tài)、挽救患兒的生命,但長期吸入高濃度的氧氣,可引起不同程度的肺損傷,嚴重者可發(fā)展為CLD。隨著機械通氣的廣泛開展、早產(chǎn)兒管理技術(shù)的日益提高及肺表面活性物質(zhì)的普遍應(yīng)用,使早產(chǎn)兒,特別是超低出生體重兒(extremely low birth weight, ELBW)(出生體重1000g存活率有了明顯改善,但隨之而來的是早產(chǎn)兒慢性肺疾病發(fā)生率的提高,國外已達30%-40%,國內(nèi)也有上升趨勢。由于尚缺乏有效的監(jiān)控和防治手段,其中10%-15%CLD患兒因嚴重肺功能障礙而死于呼吸衰竭,存活者也需長期依賴氧氣或機械通氣治療。 初期肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cell,AEC)損傷和晚期肺纖維化是CLD主要病理特征。以往的研究側(cè)重闡明CLD的AEC損傷(壞死或調(diào)亡)及其損傷后纖維組織替代AEC的病理過程及其可能機制,故目前多試圖通過減輕AEC損傷程度或減少肺組織膠原沉積而達到有效防止CLD的目的,但效果均不理想,至今在CLD防治措施方面的研究進展緩慢。但恰是這種正常肺上皮重塑障礙后的不可逆肺纖維化,嚴重影響了患兒的呼吸功能。那么損傷后的肺泡上皮為何不能完全修復(fù)而被纖維組織替代呢?目前尚無答案。因此,我們設(shè)想如以研究高氧致CLD中AEC的修復(fù)及其調(diào)控機制為切入點,可能是解決肺上皮重塑障礙的重要突破口。 AEC包括Ⅰ型肺泡上皮細胞(typeⅠalveolar epithelial cell, AEC-Ⅰ)和Ⅱ型肺泡上皮細胞(typeⅡalveolar epithelial cell, AEC-Ⅱ),已證實AEC-Ⅰ為終末已分化細胞,無再生、增殖及分化能力；目前研究證實AEC-Ⅱ是AEC-Ⅰ的干細胞或祖細胞,如體外培養(yǎng)的AEC-Ⅱ,可很快失去其特有的標志SPC(surfactant proteinC),而表達AEC-Ⅰ的特有標志AQP5 (aquaporin5);用3H-TDR標記動物體內(nèi)的AEC-Ⅱ,2天后在AEC-Ⅱ臨近發(fā)現(xiàn)標記的AEC-Ⅰ等。由此可見,若肺上皮損傷后,AEC-Ⅰ無再生、修復(fù)能力,完全依賴AEC-Ⅱ的增殖、分化方能完成正常的肺上皮的重塑。 近年來,由于Hox基因(homeobox genes, Hox genes)在進化過程中的極大保守性和其在動物胚胎發(fā)育分化中的作用,使之成為當(dāng)今世界生命科學(xué)最熱門的研究領(lǐng)域之一。而有關(guān)Hox基因?qū)φ７谓M織發(fā)育及細胞分化調(diào)控作用的研究尚處起步階段。多數(shù)文獻闡明不同簇的Hox基因在胎肺發(fā)育的特定階段、特定部位表達,對肺細胞系分化、成熟期重要作用,如HoxA5和HoxB5與支氣管分枝形成,HoxB7、HoxB8和HoxB5與肺芽發(fā)育密切相關(guān)。有個別報道HoxB5異常表達與先天性肺隔離癥、HoxA5過渡表達與原發(fā)性肺動脈高壓、肺氣腫發(fā)生有關(guān)。Hox基因?qū)ι蠓伟l(fā)育的調(diào)控機制目前尚不清楚,生后肺組織中仍存在Hox基因,其中表達最強的是HoxA5,,其次是HoxB5,且這兩種基因主要定位于肺泡上皮細胞,而AEC-Ⅰ又為終末已分化細胞,故我們推測,高氧CLD時,能否因AEC-Ⅱ的HoxA5、HoxB5基因的表達降低而導(dǎo)致其向AEC-Ⅰ的分化障礙。 我們假設(shè)：HoxA5和HoxB5基因可能是AEC-Ⅱ向AEC-Ⅰ分化的主控基因之一,其表達異常導(dǎo)致了損傷AEC-Ⅰ的修復(fù)障礙,最終發(fā)生肺上皮再生受抑,纖維組織增生替代的病理結(jié)局。如該假設(shè)成立,不僅可以闡明在正常早產(chǎn)鼠肺發(fā)育及CLD發(fā)生、發(fā)展中HoxA5、HoxB5時空表達模式,更重要的是發(fā)現(xiàn)Hox同源盒基因?qū)EC-Ⅱ分化的調(diào)控作用,從而為進一步探索有效防治早產(chǎn)兒CLD的新途徑奠定理論和實驗基礎(chǔ)。 實驗材料與方法 一、動物模型 本實驗是在中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院實驗動物中心完成。足月新生Wistar大鼠(連同母鼠)被隨機分為2組：A組即試驗組、單純高氧暴露；B組即對照組、正�？諝馕耄粚組在生后24 h內(nèi)置于玻璃氧艙中,持續(xù)輸入氧氣,維持在FiO20.85,每日兩次監(jiān)測氧濃度(美國OM-25ME型測氧儀監(jiān)測),用鈣石灰吸收CO2,使其濃度小于0.5%(美國Dapex氣體分析儀),溫度20℃-25℃,濕度50%-70%,每天開箱0.5h,稱重,添加水及飼料,更換墊料,與空氣組互換母鼠以避免母鼠因氧中毒而致護理能力降低；空氣對照組置于空氣中(Fi020.21),飼養(yǎng)條件與高氧組相同。 二、標本采集和處理 分別于實驗開始后的第1、3、7、14、21天分別從每組中隨機抽取8只新生鼠,腹腔注射5%水合氯醛6ml/kg麻醉后處死。立即打開胸腔,無菌條件下分離肺組織,取右肺各葉置于無Rnase的Eppendorf管中于-80℃冰箱中保存。取左肺置于0.1%DEPC的4%多聚甲醛(0.1MPBS, pH7.0-7.6)固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋。 三、實驗方法 1、動態(tài)觀察各組新生大鼠的一般狀態(tài)、監(jiān)測體重。 2、病理形態(tài)學(xué)研究 (1)光鏡觀察：切片進行常規(guī)HE染色,光鏡下動態(tài)觀察肺組織的病理改變。 (2)肺泡面積/肺間隔面積(A/S)(美國Universal Ima-grog Porporation圖像分析系統(tǒng))。 (3)放射狀肺泡計數(shù)(radical alveolar counts, RAC)。 (4)透射電鏡觀察AEC-Ⅱ超微結(jié)構(gòu)改變。 3、采用免疫組化(Immonohistochemistry, IH)、RT-PCR檢測肺組織AQP5、SPC的表達 4、兩組肺組織HoxA5、HoxB5蛋白含量和基因表達的動態(tài)變化 (1)免疫組化方法檢測肺組織HoxA5、HoxB5在肺組織中表達的強度和部位。 (2) RT-PCR技術(shù)檢測肺組織HoxA5、HoxB5mRNA的表達。 (3)原位雜交(Hybridization in situ, ISH)檢測表達HoxA5、HoxB5mRNA強度和部位。 (4)Western-blot (WB)方法檢測肺組織HoxA5、HoxB5蛋白定量。 四、統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,數(shù)據(jù)以均值±標準差(x±s)表示,單因素多水平比較采用One Way ANOVA。兩樣本均數(shù)間比較采用Independent t test。相關(guān)分析采用Spearman分析。結(jié)果以P0.05有意義。 結(jié)果 一、實驗組和對照組新生大鼠一般狀態(tài)比較 實驗組新生鼠1d膚色紅潤,脫離氧氣無呼吸困難,3d離氧后出現(xiàn)呼吸急促,一般在7d后出現(xiàn)少動、呼吸急促明顯、皮膚蒼白以及離氧后不同程度的發(fā)紺,隨高氧暴露時間延長而逐漸加重,在14d后出現(xiàn)對氧的依賴。而對照組組則無以上異常表現(xiàn)。 實驗組在高氧暴露7d開始,新生大鼠體重與對照組相比下降(P0.05),隨著高氧暴露時間的延長,體重差異逐漸明顯(P0.01)。 二、兩組新生大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化的比較 1、肺組織的病理改變： 對照組1d的肺組織出現(xiàn)小而淺的原始肺泡,形態(tài)不規(guī)則,肺泡間隔較厚；3d時終末氣腔大小降低,數(shù)量漸增多,肺泡間隔漸�。�7d-21d肺泡化進一步完善,到21d肺泡間隔變薄,肺泡次級隔明顯增多,肺泡數(shù)量增多,形態(tài)較規(guī)則；實驗組在高氧暴露1d后與對照組無明顯差別。3d可見小血管擴張、充血,肺泡腔內(nèi)或間隔少量出血,以中性粒細胞為主的滲出、間質(zhì)內(nèi)細胞增多。7d時炎癥反應(yīng)進一步加重,肺泡間隔水腫變寬,出現(xiàn)終末氣腔擴張、肺泡融合、肺泡分隔減少等。14d-21d間隔增寬,小灶或多灶狀實變,肺組織正常結(jié)構(gòu)破壞,且終末氣腔擴張更為明顯、小肺泡數(shù)量更少,肺泡次級隔明顯減少。 2、A/S和RAC動態(tài)變化： 生后1d和3d,兩組A/S和RAC均無差異(p0.05)。7d,14d,實驗組的A/S、RAC明顯低于對照組(p0.01),A/S高于對照組(p0.01),21d時A/S升至最高和RAC降至最低(p0.001)。 3、肺泡Ⅱ型上皮細胞超微結(jié)構(gòu)改變 正常AEC-Ⅱ的表面有大量微絨毛,細胞結(jié)構(gòu)完整,胞核呈橢圓形,核膜完整,染色質(zhì)分布均勻；胞漿內(nèi)含有線粒體和大量板層小體。吸高氧后1d,即AEC-Ⅱ的少數(shù)線粒體腫脹；3d時LB開始有排空現(xiàn)象；7d時細胞胞膜上微絨毛減少,胞核尚完整,染色質(zhì)以異染色質(zhì)為主,線粒體腫脹和板層小體空泡化；14d時,游離端大量微絨毛突出細胞表面并少量脫落,線粒體嵴斷裂,部分溶解,半層小體基本排空；21d細胞核固縮、溶解,線粒體、板層小體、微絨毛結(jié)構(gòu)均消失。 三、高氧致慢性肺疾病新生鼠肺泡上皮細胞SPC和AQP5表達及動態(tài)變化 1、高氧后新生大鼠肺組織SPC、AQP5蛋白表達的動態(tài)變化 免疫組化結(jié)果示：SPC為Ⅱ型肺泡上皮細胞標志蛋白,主要在胞漿中表達。實驗組3d明顯低于對照組(P0.05),1d、7d無明顯差異,14d、21d明顯高于對照組(P0.05)；AQP5為Ⅰ型肺泡上皮細胞的標志蛋白,胞漿、胞膜可見棕黃色染色。其表達1d、3d兩組無明顯差異,7d、14、21d實驗組均低于對照組,差異顯著(P0.05)。 2、高氧后新生大鼠肺組織SPC、AQP5mRNA表達動態(tài)變化 SPCmRNA的表達不呈直線改變,實驗組與對照組比較,1d兩組間無明顯差異,3d時實驗組明顯減少有顯著差異,7d、14d、21d時其表達有明顯增多,且相對量多于對照組,兩組間差異不顯著(P0.05)。AQP5mRNA表達量實驗組逐漸減少,14d、21d變化減緩；對照組逐漸增加且趨勢平緩。兩組間除1d外其他各組均存在顯著差異(P0.05)。 四、高氧致CLD新生大鼠肺組織HoxA5和HoxB5基因表達動態(tài)變化的實驗研究 1、高氧后新生大鼠肺組織HoxA5、HoxB5蛋白表達的動態(tài)變化 免疫組化結(jié)果顯示HoxA5在新生鼠肺組織中主要表達肺泡上皮細胞、肺間質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞,少量表達于支氣管粘膜細胞。隨著肺泡化的發(fā)生,其在肺泡上皮細胞表達增多趨勢更明顯。對照組1d、3d表達量均較多且無明顯差別(P0.05),7d后平穩(wěn)表達并且維持在較高水平。實驗組,1d、3d與對照組表達量無明顯差異(P0.05),7d開始表達量逐漸下降,14d表達最低,21d表達仍低于對照組(P0.05)。HoxB5在新生鼠肺組織中主要表達于肺泡上皮細胞、支氣管粘膜細胞、血管粘膜及粘膜下,肺間質(zhì)亦有少量表達。隨著肺泡化的發(fā)生,其在肺泡間隔及肺泡嵴上的表達也越明顯。對照組1d、3d表達量均較多且無明顯差別,7d表達達高峰,14d、21d平穩(wěn)表達并且維持在較高水平。實驗組,1d、3d與對照組表達量無明顯差異(p0.05),7d開始表達量逐漸下降,7d、14d、21d與對照組相比差異顯著(P0.05)。 Western結(jié)果與免疫組化結(jié)果基本一致,對照組HoxA5蛋白1d、3d表達較多,7d、14d、21d表達增多。實驗組HoxA5蛋白1d、3d表達較多,7d、14d、21d表達減少且與對照組存在顯著差異(P0.05)。HoxB5蛋白1d、3d表達較多,7d、14d、21d表達增多。實驗組HoxB5蛋白1d、3d表達較多,7d、14d、21d表達逐漸減少且與對照組存在顯著差異(P0.05),21d時其蛋白表達基本為陰性。 2、高氧后新生大鼠肺組織HoxA5、HoxB5mRNA表達的動態(tài)變化 RT-PCR結(jié)果顯示：對照組HoxA5mRNA1d、3d表達較多,7d、14d、21d表達增多。實驗組HoxA5mRNAld、3d表達較多,7d、14d、21d表達逐漸減少且與對照組存在顯著差異(P0.05)。HoxB5mRNA在新生鼠肺組織中表達,實驗組與對照組之間1d、3d無明顯差異(P0.05),表達較多,而7d、14d、21d差異顯著(P0.05)。實驗組7d之后HoxB5mRNA表達逐漸減少,至21d時表達已極其微弱,對照組表達的量逐漸增多,14d后表達平緩,7d、14d、21d兩組間存在顯著差異(P0.05)。 原位雜交結(jié)果：HoxA5 mRNA在新生鼠肺組織中主要表達于肺泡上皮細胞、肺間質(zhì)細胞、血管上皮細胞,支氣管粘膜上皮細胞也有少量表達。在細胞核和／胞漿中均有表達,1d、3d時肺泡間隔細胞和肺泡上皮細胞表達均較多,隨著肺泡化的發(fā)生,其在肺泡上皮細胞表達增多趨勢更明顯,實驗組3d細胞核表達量較多。對照組1d、3d表達量均較多且無明顯差別(P0.05),7d后平穩(wěn)表達并且維持在較高水平。實驗組,1d、3d與對照組表達量無明顯差異(P0.05),7d開始表達量逐漸下降,21d表達很少,7d、14d、21d兩組差異顯著(P0.05)。HoxB5 mRNA在新生鼠肺組織中主要表達于肺泡上皮細胞、支氣管粘膜細胞、血管粘膜及粘膜下,肺間質(zhì)亦有少量表達。隨著肺泡化的發(fā)生,其在肺泡間隔、肺泡連接處及肺泡嵴上的表達也越明顯。對照組1d、3d表達量均較多且無明顯差別(P0.05),7d表達達高峰,14d、21d平穩(wěn)表達并且維持在較高水平。實驗組,1d與對照組表達量無明顯差異(P0.05),3d時表達已開始減少,7d、14d、21d表達水平均較低,與對照組差異明顯(P0.05)。 結(jié)論 1、新生大鼠持續(xù)高濃度氧氣暴露,可導(dǎo)致新生大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡發(fā)育障礙和肺纖維組織增生等病理形態(tài)學(xué)改變,符合早產(chǎn)兒CLD的發(fā)生發(fā)展特點和解剖學(xué)改變。 2、高氧肺損傷肺泡發(fā)育停滯或者肺泡損傷后修復(fù)障礙在新生鼠CLD早期即有明顯表現(xiàn),隨著新生鼠高氧暴露時間的延長這一特點更加明顯。 3、新生大鼠肺組織SPC、AQP5主要表達于肺泡上皮細胞。AQP5在支氣管粘膜和小血管粘膜下層亦有表達。高氧7d后SPC表達量增多但是表達較紊亂,肺泡間隔細胞表達較多。 4、根據(jù)肺泡上皮細胞特異性標志物的變化,高氧致肺損傷,肺泡上皮細胞改變可能為：AEC-Ⅱ早期減少,隨后增加并維持在較高水平；AEC-Ⅰ進行性減少。 5、既然AEC-Ⅱ是AEC-Ⅰ的干細胞,推測高氧致新生鼠CLD肺泡損傷時可能存在AEC-Ⅱ向AEC-Ⅰ的分化障礙。 6、HoxA5和HoxB5基因在正常新生鼠肺組織中表達,在肺泡形成期,表達量呈上升趨勢。兩個基因均在肺泡上皮中表達,在肺泡嵴、肺泡拐角、肺泡連接處表達更明顯。 7、高氧致新生鼠肺損傷導(dǎo)致HoxA5、HoxB5基因表達異常,且隨著暴露時間的延長,其表達量漸低。 8、高氧致肺損傷早期肺泡上皮損傷,肺泡修復(fù)障礙,HoxA5、HoxB5基因可能調(diào)控AEC-Ⅱ轉(zhuǎn)化為AEC-Ⅰ。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R722.6

【參考文獻】

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本文編號：2716715