【摘要】： 前言 早產(chǎn)兒慢性肺疾病(chroniclungdisease,CLD)是早產(chǎn)兒長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧或機(jī)械通氣治療或感染后最常見的和最嚴(yán)重的并發(fā)癥。早產(chǎn)兒CLD作為早產(chǎn)兒肺透明膜病治療的并發(fā)癥在1967年首次被Northway描述,也稱為支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)。氧療法是患有心肺疾病的早產(chǎn)兒最常應(yīng)用的一種治療手段。這一措施雖可改變患兒的低血氧狀態(tài)、挽救患兒的生命,但長(zhǎng)期吸入高濃度的氧氣,可引起不同程度的肺損傷,嚴(yán)重者可發(fā)展為CLD。隨著機(jī)械通氣的廣泛開展、早產(chǎn)兒管理技術(shù)的日益提高及肺表面活性物質(zhì)的普遍應(yīng)用,使早產(chǎn)兒,特別是超低出生體重兒(extremely low birth weight, ELBW)(出生體重1000g存活率有了明顯改善,但隨之而來的是早產(chǎn)兒慢性肺疾病發(fā)生率的提高,國(guó)外已達(dá)30%-40%,國(guó)內(nèi)也有上升趨勢(shì)。由于尚缺乏有效的監(jiān)控和防治手段,其中10%-15%CLD患兒因嚴(yán)重肺功能障礙而死于呼吸衰竭,存活者也需長(zhǎng)期依賴氧氣或機(jī)械通氣治療。 初期肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell,AEC)損傷和晚期肺纖維化是CLD主要病理特征。以往的研究側(cè)重闡明CLD的AEC損傷(壞死或調(diào)亡)及其損傷后纖維組織替代AEC的病理過程及其可能機(jī)制,故目前多試圖通過減輕AEC損傷程度或減少肺組織膠原沉積而達(dá)到有效防止CLD的目的,但效果均不理想,至今在CLD防治措施方面的研究進(jìn)展緩慢。但恰是這種正常肺上皮重塑障礙后的不可逆肺纖維化,嚴(yán)重影響了患兒的呼吸功能。那么損傷后的肺泡上皮為何不能完全修復(fù)而被纖維組織替代呢?目前尚無答案。因此,我們?cè)O(shè)想如以研究高氧致CLD中AEC的修復(fù)及其調(diào)控機(jī)制為切入點(diǎn),可能是解決肺上皮重塑障礙的重要突破口。 AEC包括Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞(typeⅠalveolar epithelial cell, AEC-Ⅰ)和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(typeⅡalveolar epithelial cell, AEC-Ⅱ),已證實(shí)AEC-Ⅰ為終末已分化細(xì)胞,無再生、增殖及分化能力；目前研究證實(shí)AEC-Ⅱ是AEC-Ⅰ的干細(xì)胞或祖細(xì)胞,如體外培養(yǎng)的AEC-Ⅱ,可很快失去其特有的標(biāo)志SPC(surfactant proteinC),而表達(dá)AEC-Ⅰ的特有標(biāo)志AQP5 (aquaporin5);用3H-TDR標(biāo)記動(dòng)物體內(nèi)的AEC-Ⅱ,2天后在AEC-Ⅱ臨近發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的AEC-Ⅰ等。由此可見,若肺上皮損傷后,AEC-Ⅰ無再生、修復(fù)能力,完全依賴AEC-Ⅱ的增殖、分化方能完成正常的肺上皮的重塑。 近年來,由于Hox基因(homeobox genes, Hox genes)在進(jìn)化過程中的極大保守性和其在動(dòng)物胚胎發(fā)育分化中的作用,使之成為當(dāng)今世界生命科學(xué)最熱門的研究領(lǐng)域之一。而有關(guān)Hox基因?qū)φ７谓M織發(fā)育及細(xì)胞分化調(diào)控作用的研究尚處起步階段。多數(shù)文獻(xiàn)闡明不同簇的Hox基因在胎肺發(fā)育的特定階段、特定部位表達(dá),對(duì)肺細(xì)胞系分化、成熟期重要作用,如HoxA5和HoxB5與支氣管分枝形成,HoxB7、HoxB8和HoxB5與肺芽發(fā)育密切相關(guān)。有個(gè)別報(bào)道HoxB5異常表達(dá)與先天性肺隔離癥、HoxA5過渡表達(dá)與原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、肺氣腫發(fā)生有關(guān)。Hox基因?qū)ι蠓伟l(fā)育的調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚,生后肺組織中仍存在Hox基因,其中表達(dá)最強(qiáng)的是HoxA5,,其次是HoxB5,且這兩種基因主要定位于肺泡上皮細(xì)胞,而AEC-Ⅰ又為終末已分化細(xì)胞,故我們推測(cè),高氧CLD時(shí),能否因AEC-Ⅱ的HoxA5、HoxB5基因的表達(dá)降低而導(dǎo)致其向AEC-Ⅰ的分化障礙。 我們假設(shè)：HoxA5和HoxB5基因可能是AEC-Ⅱ向AEC-Ⅰ分化的主控基因之一,其表達(dá)異常導(dǎo)致了損傷AEC-Ⅰ的修復(fù)障礙,最終發(fā)生肺上皮再生受抑,纖維組織增生替代的病理結(jié)局。如該假設(shè)成立,不僅可以闡明在正常早產(chǎn)鼠肺發(fā)育及CLD發(fā)生、發(fā)展中HoxA5、HoxB5時(shí)空表達(dá)模式,更重要的是發(fā)現(xiàn)Hox同源盒基因?qū)EC-Ⅱ分化的調(diào)控作用,從而為進(jìn)一步探索有效防治早產(chǎn)兒CLD的新途徑奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)材料與方法 一、動(dòng)物模型 本實(shí)驗(yàn)是在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。足月新生Wistar大鼠(連同母鼠)被隨機(jī)分為2組：A組即試驗(yàn)組、單純高氧暴露；B組即對(duì)照組、正�？諝馕耄粚組在生后24 h內(nèi)置于玻璃氧艙中,持續(xù)輸入氧氣,維持在FiO20.85,每日兩次監(jiān)測(cè)氧濃度(美國(guó)OM-25ME型測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)),用鈣石灰吸收CO2,使其濃度小于0.5%(美國(guó)Dapex氣體分析儀),溫度20℃-25℃,濕度50%-70%,每天開箱0.5h,稱重,添加水及飼料,更換墊料,與空氣組互換母鼠以避免母鼠因氧中毒而致護(hù)理能力降低；空氣對(duì)照組置于空氣中(Fi020.21),飼養(yǎng)條件與高氧組相同。 二、標(biāo)本采集和處理 分別于實(shí)驗(yàn)開始后的第1、3、7、14、21天分別從每組中隨機(jī)抽取8只新生鼠,腹腔注射5%水合氯醛6ml/kg麻醉后處死。立即打開胸腔,無菌條件下分離肺組織,取右肺各葉置于無Rnase的Eppendorf管中于-80℃冰箱中保存。取左肺置于0.1%DEPC的4%多聚甲醛(0.1MPBS, pH7.0-7.6)固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋。 三、實(shí)驗(yàn)方法 1、動(dòng)態(tài)觀察各組新生大鼠的一般狀態(tài)、監(jiān)測(cè)體重。 2、病理形態(tài)學(xué)研究 (1)光鏡觀察：切片進(jìn)行常規(guī)HE染色,光鏡下動(dòng)態(tài)觀察肺組織的病理改變。 (2)肺泡面積/肺間隔面積(A/S)(美國(guó)Universal Ima-grog Porporation圖像分析系統(tǒng))。 (3)放射狀肺泡計(jì)數(shù)(radical alveolar counts, RAC)。 (4)透射電鏡觀察AEC-Ⅱ超微結(jié)構(gòu)改變。 3、采用免疫組化(Immonohistochemistry, IH)、RT-PCR檢測(cè)肺組織AQP5、SPC的表達(dá) 4、兩組肺組織HoxA5、HoxB5蛋白含量和基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 (1)免疫組化方法檢測(cè)肺組織HoxA5、HoxB5在肺組織中表達(dá)的強(qiáng)度和部位。 (2) RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織HoxA5、HoxB5mRNA的表達(dá)。 (3)原位雜交(Hybridization in situ, ISH)檢測(cè)表達(dá)HoxA5、HoxB5mRNA強(qiáng)度和部位。 (4)Western-blot (WB)方法檢測(cè)肺組織HoxA5、HoxB5蛋白定量。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,單因素多水平比較采用One Way ANOVA。兩樣本均數(shù)間比較采用Independent t test。相關(guān)分析采用Spearman分析。結(jié)果以P0.05有意義。 結(jié)果 一、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組新生大鼠一般狀態(tài)比較 實(shí)驗(yàn)組新生鼠1d膚色紅潤(rùn),脫離氧氣無呼吸困難,3d離氧后出現(xiàn)呼吸急促,一般在7d后出現(xiàn)少動(dòng)、呼吸急促明顯、皮膚蒼白以及離氧后不同程度的發(fā)紺,隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加重,在14d后出現(xiàn)對(duì)氧的依賴。而對(duì)照組組則無以上異常表現(xiàn)。 實(shí)驗(yàn)組在高氧暴露7d開始,新生大鼠體重與對(duì)照組相比下降(P0.05),隨著高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng),體重差異逐漸明顯(P0.01)。 二、兩組新生大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化的比較 1、肺組織的病理改變： 對(duì)照組1d的肺組織出現(xiàn)小而淺的原始肺泡,形態(tài)不規(guī)則,肺泡間隔較厚；3d時(shí)終末氣腔大小降低,數(shù)量漸增多,肺泡間隔漸��；7d-21d肺泡化進(jìn)一步完善,到21d肺泡間隔變薄,肺泡次級(jí)隔明顯增多,肺泡數(shù)量增多,形態(tài)較規(guī)則；實(shí)驗(yàn)組在高氧暴露1d后與對(duì)照組無明顯差別。3d可見小血管擴(kuò)張、充血,肺泡腔內(nèi)或間隔少量出血,以中性粒細(xì)胞為主的滲出、間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞增多。7d時(shí)炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重,肺泡間隔水腫變寬,出現(xiàn)終末氣腔擴(kuò)張、肺泡融合、肺泡分隔減少等。14d-21d間隔增寬,小灶或多灶狀實(shí)變,肺組織正常結(jié)構(gòu)破壞,且終末氣腔擴(kuò)張更為明顯、小肺泡數(shù)量更少,肺泡次級(jí)隔明顯減少。 2、A/S和RAC動(dòng)態(tài)變化： 生后1d和3d,兩組A/S和RAC均無差異(p0.05)。7d,14d,實(shí)驗(yàn)組的A/S、RAC明顯低于對(duì)照組(p0.01),A/S高于對(duì)照組(p0.01),21d時(shí)A/S升至最高和RAC降至最低(p0.001)。 3、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變 正常AEC-Ⅱ的表面有大量微絨毛,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,胞核呈橢圓形,核膜完整,染色質(zhì)分布均勻；胞漿內(nèi)含有線粒體和大量板層小體。吸高氧后1d,即AEC-Ⅱ的少數(shù)線粒體腫脹；3d時(shí)LB開始有排空現(xiàn)象；7d時(shí)細(xì)胞胞膜上微絨毛減少,胞核尚完整,染色質(zhì)以異染色質(zhì)為主,線粒體腫脹和板層小體空泡化；14d時(shí),游離端大量微絨毛突出細(xì)胞表面并少量脫落,線粒體嵴斷裂,部分溶解,半層小體基本排空；21d細(xì)胞核固縮、溶解,線粒體、板層小體、微絨毛結(jié)構(gòu)均消失。 三、高氧致慢性肺疾病新生鼠肺泡上皮細(xì)胞SPC和AQP5表達(dá)及動(dòng)態(tài)變化 1、高氧后新生大鼠肺組織SPC、AQP5蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 免疫組化結(jié)果示：SPC為Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白,主要在胞漿中表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組3d明顯低于對(duì)照組(P0.05),1d、7d無明顯差異,14d、21d明顯高于對(duì)照組(P0.05)；AQP5為Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白,胞漿、胞膜可見棕黃色染色。其表達(dá)1d、3d兩組無明顯差異,7d、14、21d實(shí)驗(yàn)組均低于對(duì)照組,差異顯著(P0.05)。 2、高氧后新生大鼠肺組織SPC、AQP5mRNA表達(dá)動(dòng)態(tài)變化 SPCmRNA的表達(dá)不呈直線改變,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,1d兩組間無明顯差異,3d時(shí)實(shí)驗(yàn)組明顯減少有顯著差異,7d、14d、21d時(shí)其表達(dá)有明顯增多,且相對(duì)量多于對(duì)照組,兩組間差異不顯著(P0.05)。AQP5mRNA表達(dá)量實(shí)驗(yàn)組逐漸減少,14d、21d變化減緩；對(duì)照組逐漸增加且趨勢(shì)平緩。兩組間除1d外其他各組均存在顯著差異(P0.05)。 四、高氧致CLD新生大鼠肺組織HoxA5和HoxB5基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變化的實(shí)驗(yàn)研究 1、高氧后新生大鼠肺組織HoxA5、HoxB5蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 免疫組化結(jié)果顯示HoxA5在新生鼠肺組織中主要表達(dá)肺泡上皮細(xì)胞、肺間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞,少量表達(dá)于支氣管粘膜細(xì)胞。隨著肺泡化的發(fā)生,其在肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)增多趨勢(shì)更明顯。對(duì)照組1d、3d表達(dá)量均較多且無明顯差別(P0.05),7d后平穩(wěn)表達(dá)并且維持在較高水平。實(shí)驗(yàn)組,1d、3d與對(duì)照組表達(dá)量無明顯差異(P0.05),7d開始表達(dá)量逐漸下降,14d表達(dá)最低,21d表達(dá)仍低于對(duì)照組(P0.05)。HoxB5在新生鼠肺組織中主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、支氣管粘膜細(xì)胞、血管粘膜及粘膜下,肺間質(zhì)亦有少量表達(dá)。隨著肺泡化的發(fā)生,其在肺泡間隔及肺泡嵴上的表達(dá)也越明顯。對(duì)照組1d、3d表達(dá)量均較多且無明顯差別,7d表達(dá)達(dá)高峰,14d、21d平穩(wěn)表達(dá)并且維持在較高水平。實(shí)驗(yàn)組,1d、3d與對(duì)照組表達(dá)量無明顯差異(p0.05),7d開始表達(dá)量逐漸下降,7d、14d、21d與對(duì)照組相比差異顯著(P0.05)。 Western結(jié)果與免疫組化結(jié)果基本一致,對(duì)照組HoxA5蛋白1d、3d表達(dá)較多,7d、14d、21d表達(dá)增多。實(shí)驗(yàn)組HoxA5蛋白1d、3d表達(dá)較多,7d、14d、21d表達(dá)減少且與對(duì)照組存在顯著差異(P0.05)。HoxB5蛋白1d、3d表達(dá)較多,7d、14d、21d表達(dá)增多。實(shí)驗(yàn)組HoxB5蛋白1d、3d表達(dá)較多,7d、14d、21d表達(dá)逐漸減少且與對(duì)照組存在顯著差異(P0.05),21d時(shí)其蛋白表達(dá)基本為陰性。 2、高氧后新生大鼠肺組織HoxA5、HoxB5mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 RT-PCR結(jié)果顯示：對(duì)照組HoxA5mRNA1d、3d表達(dá)較多,7d、14d、21d表達(dá)增多。實(shí)驗(yàn)組HoxA5mRNAld、3d表達(dá)較多,7d、14d、21d表達(dá)逐漸減少且與對(duì)照組存在顯著差異(P0.05)。HoxB5mRNA在新生鼠肺組織中表達(dá),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間1d、3d無明顯差異(P0.05),表達(dá)較多,而7d、14d、21d差異顯著(P0.05)。實(shí)驗(yàn)組7d之后HoxB5mRNA表達(dá)逐漸減少,至21d時(shí)表達(dá)已極其微弱,對(duì)照組表達(dá)的量逐漸增多,14d后表達(dá)平緩,7d、14d、21d兩組間存在顯著差異(P0.05)。 原位雜交結(jié)果：HoxA5 mRNA在新生鼠肺組織中主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、肺間質(zhì)細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞,支氣管粘膜上皮細(xì)胞也有少量表達(dá)。在細(xì)胞核和／胞漿中均有表達(dá),1d、3d時(shí)肺泡間隔細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)均較多,隨著肺泡化的發(fā)生,其在肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)增多趨勢(shì)更明顯,實(shí)驗(yàn)組3d細(xì)胞核表達(dá)量較多。對(duì)照組1d、3d表達(dá)量均較多且無明顯差別(P0.05),7d后平穩(wěn)表達(dá)并且維持在較高水平。實(shí)驗(yàn)組,1d、3d與對(duì)照組表達(dá)量無明顯差異(P0.05),7d開始表達(dá)量逐漸下降,21d表達(dá)很少,7d、14d、21d兩組差異顯著(P0.05)。HoxB5 mRNA在新生鼠肺組織中主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、支氣管粘膜細(xì)胞、血管粘膜及粘膜下,肺間質(zhì)亦有少量表達(dá)。隨著肺泡化的發(fā)生,其在肺泡間隔、肺泡連接處及肺泡嵴上的表達(dá)也越明顯。對(duì)照組1d、3d表達(dá)量均較多且無明顯差別(P0.05),7d表達(dá)達(dá)高峰,14d、21d平穩(wěn)表達(dá)并且維持在較高水平。實(shí)驗(yàn)組,1d與對(duì)照組表達(dá)量無明顯差異(P0.05),3d時(shí)表達(dá)已開始減少,7d、14d、21d表達(dá)水平均較低,與對(duì)照組差異明顯(P0.05)。 結(jié)論 1、新生大鼠持續(xù)高濃度氧氣暴露,可導(dǎo)致新生大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡發(fā)育障礙和肺纖維組織增生等病理形態(tài)學(xué)改變,符合早產(chǎn)兒CLD的發(fā)生發(fā)展特點(diǎn)和解剖學(xué)改變。 2、高氧肺損傷肺泡發(fā)育停滯或者肺泡損傷后修復(fù)障礙在新生鼠CLD早期即有明顯表現(xiàn),隨著新生鼠高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)這一特點(diǎn)更加明顯。 3、新生大鼠肺組織SPC、AQP5主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞。AQP5在支氣管粘膜和小血管粘膜下層亦有表達(dá)。高氧7d后SPC表達(dá)量增多但是表達(dá)較紊亂,肺泡間隔細(xì)胞表達(dá)較多。 4、根據(jù)肺泡上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物的變化,高氧致肺損傷,肺泡上皮細(xì)胞改變可能為：AEC-Ⅱ早期減少,隨后增加并維持在較高水平；AEC-Ⅰ進(jìn)行性減少。 5、既然AEC-Ⅱ是AEC-Ⅰ的干細(xì)胞,推測(cè)高氧致新生鼠CLD肺泡損傷時(shí)可能存在AEC-Ⅱ向AEC-Ⅰ的分化障礙。 6、HoxA5和HoxB5基因在正常新生鼠肺組織中表達(dá),在肺泡形成期,表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。兩個(gè)基因均在肺泡上皮中表達(dá),在肺泡嵴、肺泡拐角、肺泡連接處表達(dá)更明顯。 7、高氧致新生鼠肺損傷導(dǎo)致HoxA5、HoxB5基因表達(dá)異常,且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),其表達(dá)量漸低。 8、高氧致肺損傷早期肺泡上皮損傷,肺泡修復(fù)障礙,HoxA5、HoxB5基因可能調(diào)控AEC-Ⅱ轉(zhuǎn)化為AEC-Ⅰ。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R722.6

【參考文獻(xiàn)】

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