【摘要】： 1999年從呼吸道感染導(dǎo)致死亡的靈長(zhǎng)類動(dòng)物普通棉耳狨猴肺組織中分離到一株病毒,該毒株與普通棉耳狨猴下呼吸道感染之間符合科赫原則。分離株經(jīng)電鏡觀察,具有典型的副粘病毒特征;交叉血凝抑制試驗(yàn)、RT-PCR擴(kuò)增HN基因并測(cè)序、生物信息學(xué)方法進(jìn)行核酸序列的聯(lián)配檢索和系統(tǒng)進(jìn)化分析,表明該毒株與仙臺(tái)病毒(SeV)的同源性較高,但推導(dǎo)出的氨基酸序列仍存在較大的差異,暫時(shí)命名為副粘病毒Tianjn株。進(jìn)一步的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,動(dòng)物中心工作人員都含有此病毒的抗體;正常人群(獻(xiàn)血員)中對(duì)此病毒的抗體陽(yáng)性率高達(dá)46.7%;患急性呼吸道感染的兒童抗體陽(yáng)性率為30～37%,說(shuō)明此病毒與人類關(guān)系密切。更重要的是,SeV是嚙齒類動(dòng)物致死性病原體,而在普通棉耳狨猴呼吸道疾病流行期間,飼養(yǎng)在同一實(shí)驗(yàn)中心的各種實(shí)驗(yàn)用鼠無(wú)一例發(fā)病。因而可能是SeV發(fā)生了某些變異而跨越了種屬界限,形成對(duì)嚙齒類動(dòng)物致病性低,對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物乃至人類致病性高的毒株。目前,我們已經(jīng)完成了對(duì)該株病毒的全基因組測(cè)序(Genbank accession number:EF679198),全基因組序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析,也說(shuō)明與SeV同源性較高,證明了該株病毒為SeV的一個(gè)新基因型。 為了進(jìn)一步在分子水平上了解其蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,探討致病機(jī)制,建立簡(jiǎn)便、快速、特異的檢測(cè)方法,本研究根據(jù)全基因組序列,設(shè)計(jì)合成了三對(duì)引物,分三段擴(kuò)增了副粘病毒Tianjin株的核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,NP)基因,將擴(kuò)增片段與質(zhì)粒pET28a連接,分別構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-NP1、pET28a-NP2和pET28a-NP3。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和純化,獲得了重組蛋白NP1、NP2和NP3。以超速離心純化的病毒和純化的重組蛋白分別免疫兔子和小鼠,制備了多克隆抗體(PcAb);ELISA、dot blot和western blot方法檢測(cè)了重組蛋白NP1、NP2和NP3的免疫反應(yīng)性;分別以重組蛋白NP1、NP2和NP3為抗原,間接ELISA法檢測(cè)了186例下呼吸道感染患兒血清中的IgG、IgM,并與全病毒抗原ELISA法進(jìn)行了比較。制備了重組蛋白的單克隆抗體(McAb),對(duì)McAb的抗原識(shí)別位點(diǎn)、穩(wěn)定性、特異性作了初步分析。 結(jié)果表明:(1)重組蛋白NP1、NP2和NP3能與副粘病毒Tianjin株兔多克隆抗血清特異反應(yīng),具有天然抗原性,而且抗原性強(qiáng)弱明顯不同,NP3最強(qiáng),其余依次為NP1和NP2。(2)重組蛋白NP1、NP2和NP3的PcAb與常見(jiàn)呼吸道病原體,如甲、乙型流感病毒,肺炎支原體,甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株(FM1株)無(wú)明顯反應(yīng)性;NP1和NP3抗血清與副流感病毒Ⅰ、Ⅲ型,NDV呈陽(yáng)性反應(yīng),NP2抗血清僅與副流感病毒Ⅲ型呈陽(yáng)性反應(yīng);而副粘病毒Tianjin株鼠多克隆抗血清與除肺炎支原體以外的上述病原體均有交叉反應(yīng)。由于重組蛋白比全病毒抗原易獲得、更安全、有利于提高特異性和敏感性,以重組蛋白NP1、NP2和NP3為抗原檢測(cè)抗體,比全病毒抗原更有優(yōu)勢(shì)。(3)全病毒抗原ELISA法檢測(cè)186例患兒血清標(biāo)本IgG、IgM的陽(yáng)性率分別是30.65%和19.89%;重組蛋白NP1、NP2和NP3為抗原,IgG陽(yáng)性率分別為24.19%、22.04%、20.97%;IgM陽(yáng)性率分別為18.82%、16.67%、15.60%。重組蛋白ELISA法比全病毒抗原ELISA法有特異性更好的趨勢(shì)。(4)獲得了一株穩(wěn)定分泌NP2 McAb的細(xì)胞株G1B9D5。該細(xì)胞株培養(yǎng)上清液與NP1和NP3不結(jié)合,說(shuō)明這株McAb的抗原識(shí)別位點(diǎn)在NP蛋白aa202-aa324范圍內(nèi)。McAb G1B9D5與常見(jiàn)下呼吸道感染病原體沒(méi)有交叉反應(yīng),特異性好。為進(jìn)一步研究病毒蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及致病機(jī)制,建立快速、敏感、特異的檢測(cè)副粘病毒Tianjin株的方法奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R725.6

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本文編號(hào)：2716226