【摘要】： 目的： 先天性甲狀腺功能減低癥(先天性甲低)是由于甲狀腺激素(TH)合成不足所造成的一種兒科常見的內(nèi)分泌代謝性疾病,是造成兒童智力障礙的重要原因之 所以一直是兒童內(nèi)分泌醫(yī)務(wù)人員關(guān)注的重點。隨著分子生物學的發(fā)展,對TH生理作用有了更深入了解,TH在細胞核內(nèi)與其受體(TR)結(jié)合,作用于靶基因啟動子的甲狀腺激素反應元件(TREs),在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)靶基因的表達,然而甲低具體通過影響哪些基因?qū)е聝和橇φ系K目前尚不十分清楚。信號蛋白和相關(guān)的功能蛋白是細胞各種信息傳導及各種功能代謝活動的執(zhí)行者,是神經(jīng)細胞生長、分化等活動的基礎(chǔ),也是神經(jīng)感覺、運動、學習和記憶等功能活動形成機制的重要環(huán)節(jié),深入研究TH對腦組織信號系統(tǒng)相關(guān)蛋白的基因?qū)W調(diào)節(jié),能更全面揭示甲狀腺調(diào)控腦發(fā)育機制和先天性甲低的發(fā)病機制。 神經(jīng)系統(tǒng)經(jīng)典的細胞信號傳遞主要指突觸部位的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞,以往研究表明TH參與多種神經(jīng)遞質(zhì)的合成、降解,以及其受體表達和功能。近來,研究表明神經(jīng)系統(tǒng)還存在一些非經(jīng)典的信號傳導系統(tǒng),如一氧化氮(NO),它也介導了神經(jīng)系統(tǒng)一些重要的功能。 NO是一種細胞信息分子,具有親脂性,微溶于水的,既可以透過細胞的水相,也可以透過脂相。NO的半衰期很短,可能僅幾秒鐘。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)是NO合成中唯一的、關(guān)鍵的限速酶,它主要有三種表型,神經(jīng)型(nNOS)、誘導型(iNOS)和內(nèi)皮型(eNOS),另外還有線粒體型(mtNOS)。nNOS和eNOS分別存在于神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細胞內(nèi),其持續(xù)的產(chǎn)生低濃度的NO,主要參與臟器血流的調(diào)節(jié)和神經(jīng)的信息傳遞等。iNOS幾乎存在于所有組織中,在病理狀況下由多種細胞因子或炎癥刺激靶細胞大量表達,產(chǎn)生過量NO,主要參與炎癥和免疫反應。中樞神經(jīng)系統(tǒng),NO作為一種新的細胞間信息交換的載體,兼有第二信使和神經(jīng)傳遞的功能,它可從突觸后迅速擴散到突觸前末梢,發(fā)揮各種生理功能,因此腦神經(jīng)元產(chǎn)生的NO往往是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個反饋信息分子,現(xiàn)已證明NO對多種神經(jīng)功能活動均具有重要的影響。 由于NO的化學性質(zhì)極不穩(wěn)定,體內(nèi)NO生成的主要限速因素是NOS,故常需依賴于對NOS的研究來了解NO的分布和量。Ueta等研究發(fā)現(xiàn)甲低可導致成年大鼠下丘腦視上核和室旁核NOS基因的表達明顯下降,但未見先天性甲低對大腦皮層不同亞型NOS表達影響的報道。 在此,我們通過建立先天性甲狀腺功能減低癥的動物模型,檢測先天性甲低仔鼠大腦皮層nNOS、iNOS和eNOS的表達,了解先天性甲低對仔鼠大腦皮層nNOS、iNOS知eNOS表達的影響。 方法： 1.模型建立和分組 清潔級健康成年C57BL/6J合籠交配后自行產(chǎn)子,按處理條件不同分甲低組和對照組。 甲低組：合籠第10天開始給予母鼠含0.03%甲巰咪唑的飲用水,一直到仔鼠出生7天后。 對照組：一直用清潔飲用水喂養(yǎng),其它實驗控制因素同甲低組。 在仔鼠出生1、7、14和21天麻醉后處死,生理鹽水灌注,留取大腦皮層標本。 2. Real time RT-PCR檢測 采用Real time RT-PCR檢測nNOS、iNOS和eNOS的mRNA水平。采用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒提取腦組織總RNA,采用自行設(shè)計引物和Takara熒光PCR試劑盒進行PCR擴增,其中nNOS采用兩步法,eNOS和iNOS采用三步法。目的基因mRNA水平采用ΔCt表示,并應用ΔCt進行組間比較,ACt=Ct(目的基因)-Ct (GAPDH),ΔCt越小表明mRNA水平越高。 3.免疫組化 新鮮腦組織予10%中性福爾馬林固定和石蠟包埋,采用"EnvisionTM二步法”進行免疫組化檢測。 結(jié)果： 先天性甲低對NOS表達的影響 甲低組nNOSmRNA較對照組下降,在1和7天差異在邊界水平,14天差異具有顯著性意義。免疫組化顯示大腦皮層的nNOS表達以神經(jīng)元胞體陽性為主,神經(jīng)纖維基本陰性。與對照組比較,甲低組大腦皮層nNOS免疫陽性較低。 甲低組iNOSmRNA明顯升高,在1和7天差異具有顯著性意義。免疫組化顯示大腦皮層的iNOS表達,以神經(jīng)元胞體尤為豐富,神經(jīng)纖維基本陰性。與對照組比較,甲低組大腦皮層iNOS免疫陽性明顯高。 免疫組化顯示大腦皮層和腦膜微小血管上皮的eNOS豐富,而神經(jīng)細胞和神經(jīng)纖維均陰性。對照組與甲低組間eNOSmRNA的差異均無顯著性意義。 討論： 先天性甲低是兒科常見的內(nèi)分泌代謝性疾病之一,可導致腦機能發(fā)生不可逆損害。信息傳遞是神經(jīng)系統(tǒng)學習、記憶和思維等高級活動的基礎(chǔ),神經(jīng)科學家已對神經(jīng)元化學突觸間的信息處理和傳遞功能進行了比較廣泛而深入的研究,然而神經(jīng)系統(tǒng)還有不少非經(jīng)典的信息傳遞途徑,如NO信號系統(tǒng),研究表明它也介導了神經(jīng)系統(tǒng)一些重要的功能。那么,先天性甲低是否會通過影響大腦NO信號系統(tǒng)表達導致腦功能機能障礙呢?目前尚無相關(guān)報道。 NO作為一種新的信號傳遞物質(zhì),其與甲狀腺激素關(guān)系的研究成為一個新的熱點。由于NO的化學性質(zhì)極不穩(wěn)定,半衰期短,體內(nèi)NOS是NO合成中關(guān)鍵的限速酶,故常依賴于對NOS的研究來了解NO的分布和量,我們對其3種主要亞型表達情況進行了研究。 本研究證實nNOS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達,主要在神經(jīng)元的胞漿。研究還發(fā)現(xiàn)先天性甲低新生小鼠大腦皮層nNOS的mRNA表達下降,在停用MMI水后7天時最為明顯,說明TH可通過調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)NO含量及NO/CG信號轉(zhuǎn)導通路的活性來發(fā)揮對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用,甲低可通過減少nNOS表達降低神經(jīng)元NO合成,影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)的機能。本研究表明,生理情況下仔鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)可有微量的iNOS表達,甲低時iNOS表達增加,主要分布部分神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞,提示其NO的主要作用應不在于生理調(diào)節(jié),而很可能是參與一種損傷機制。NO除作為信使外,也是種活潑的自由基,過量NO與超氧化物結(jié)合可生成具更高毒性的過氧化物硝酸根陰離子,這些分子可能通過自分泌或旁分泌的方式在繼發(fā)損害的過程中起作用,能造成脂質(zhì)膜損傷、抑制細胞能量代謝和DNA的合成修復,并引發(fā)細胞凋亡和壞死。因此,iNOS產(chǎn)生過量的NO則可能也是甲低時腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡增加的原因之一。雖然臨床上已有許多有關(guān)甲狀腺功能疾病與血壓異常有關(guān)的報道,我們也證實eNOS在大腦皮層和腦膜微小血管內(nèi)皮有表達,但未發(fā)現(xiàn)先天性甲低對大腦皮層eNOSmRNA表達的影響,提示甲低血壓等異常并不通過顱內(nèi)血管內(nèi)皮細胞分泌NO來調(diào)節(jié)。 先天性甲低是如何導致NOS表達變化的呢?目前尚不明了。TH主要通過與TR結(jié)合調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用,TR屬于配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子,它通過與特定的TREs結(jié)合而發(fā)揮作用。我們分析小鼠NOS啟動子序列,發(fā)現(xiàn)他們的啟動子均有TREs或TREs結(jié)構(gòu)類似的DNA序列,提示TH可能直接參與調(diào)節(jié)這些基因的表達。然而,本研究發(fā)現(xiàn)兩組間僅nNOS和iNOS表達有差異,而eNOS表達沒有變化,且表達有差異的時間點也不一致。這些差異提示TH對基因調(diào)控可能具有時空的差異,即TH可能僅在特定時間調(diào)控特定組織或細胞的特定基因轉(zhuǎn)錄。 TREs按其對基因轉(zhuǎn)錄影響可分為正性和負性TREs。正性TERs在沒有結(jié)合配體的TR對靶基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄有抑制作用,激活性配體(如T3)與TR結(jié)合后促進靶基因的轉(zhuǎn)錄,負性TER則發(fā)揮相反的作用。本研究發(fā)現(xiàn)先天性甲低小鼠大腦皮層nNOS下降。我們推測nNOS基因啟動子區(qū)域存在的TRE是正性的。然而iNOS表達的改變與nNOS相反。我們推測這可能與：nNOS下降導致神經(jīng)細胞元間信號交流能力下降有關(guān),還可能還與甲低導致細胞因子和凋亡增加有關(guān)。 總之,本研究發(fā)現(xiàn)先天性甲低仔鼠大腦皮層nNOS表達下降和iNOS表達上升,提示先天性甲低影響神經(jīng)細胞NO系統(tǒng),NO系統(tǒng)異常可能是先天性甲低導致腦功能障礙的機制之一。另外,TH對基因調(diào)控可能具有時空性。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R722.1
【圖文】：

浙江大學碩士學位論文實驗材料與方法nNOS采用兩步法，eNOS和iNOS采用三步法，內(nèi)參GAPDH擴增條件與同時擴增的目的基因相同。表L4各基因的擴增條件stageZ(PeR反應，共40循環(huán))StagelStePIStePZSteP3nNOS94.OoCX3’94.ooCxls”62.ooCxl’NOS95.0oCx395.ooCxls”58.ooCxls”72OCX35”eNOS95.0oCx3’95.ooCxls”58.ooCxls”72oCx35”各目標基因RealtimePCR時的溶解曲線如圖1.1�？�.目目.口巨曰.....洲日

位論文果nNOS表達的影響S的mRNAealtimePCR擴增曲線良好(圖2.1)，PCR結(jié)果顯示對△Ct均較小，出生后1周最大(表2.1和圖2.2)，即nNOS，但在出生有下降，1周齡時最低。與對照組比較，甲低7天差異在邊界水平(P=1.033，P=0.066)，14天差異3)，在21天時差異不具有顯著性意義(P<0.05)o)晰生月‘日白一一一

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 肖建英,李雅楠,高淑賢,王翠瑤;甲狀腺激素對仔鼠大腦皮質(zhì)中NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導通路的作用[J];中國地方病學雜志;2005年03期

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本文編號：2715355