【摘要】：背景:新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic induced brain damage,HIBD)是多種因素引起的胎兒或新生兒腦缺氧和/或缺血所致的疾病,干細(xì)胞在其治療中成為研究熱點(diǎn)。課題組前期實驗在CoCl_2預(yù)處理模擬缺氧條件下發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α參與間充質(zhì)干細(xì)胞對HIBD大鼠的認(rèn)知修復(fù)過程及神經(jīng)元突觸可塑性調(diào)節(jié);研究發(fā)現(xiàn)PTEN也廣泛參與缺血性腦損傷的病理生理過程及AMPA受體的突觸調(diào)節(jié),但具體機(jī)制尚不清楚。目的:探討B(tài)MSCs旁分泌對海馬神經(jīng)元OGD損傷后的保護(hù)作用及與HIF-1α和PTEN兩者間關(guān)系。方法:1.采用雙層培養(yǎng)皿嵌套分離共培養(yǎng),BMSCs與海馬神經(jīng)元無直接接觸,但其分泌因子能發(fā)揮作用。實驗分為((1)常氧培養(yǎng)組(Control)、(2)氧糖剝奪組(Oxygen-glucose deprivation,OGD)、(3)氧糖剝奪分離共培養(yǎng)組(OGD+OGD-BMSCs)、(4)氧糖剝奪海馬神經(jīng)元與HIF-1α激動劑CoCl_2預(yù)處理的BMSCs分離共培養(yǎng)組(OGD+CoCl_2-BMSCs)、(5)氧糖剝奪海馬神經(jīng)元與HIF-1α激動劑CoCl_2及HIF-1α抑制劑2ME-2預(yù)處理的BMSCs分離共培養(yǎng)組(OGD+2ME-2-CoCl_2-BMSCs)、(6)PTEN抑制劑bpV預(yù)處理氧糖剝奪海馬神經(jīng)元組(OGD+bpV)。2.24小時后行LDH及AnnexinV-FITC/PI實驗檢測神經(jīng)元細(xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡水平以研究BMSCs對海馬神經(jīng)元OGD損傷后的保護(hù)效應(yīng)及HIF-1α、PTEN在此過程中的作用;3.提取BMSCs與海馬神經(jīng)元蛋白,行Western blot實驗明確各組中HIF-1α蛋白、PTEN蛋白及p-PTEN蛋白表達(dá)水平變化;4.ELISA檢測BMSCs各組中VEGF蛋白水平以論證BMSCs的旁分泌效應(yīng);5.免疫共沉淀及ChIP-qPCR探討B(tài)MSCs及海馬神經(jīng)元中HIF-1α和PTEN間相互作用關(guān)系。結(jié)果:(1)LDH及AnnexinV-FITC/PI檢測結(jié)果顯示:與BMSCs分離共培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷程度(P0.01)及細(xì)胞凋亡水平(P0.001)在氧糖剝奪后明顯下降;而HIF-1α抑制劑2ME-2預(yù)處理后海馬神經(jīng)元損傷程度及凋亡水平增高(P0.001);PTEN抑制劑bpV預(yù)處理氧糖剝奪海馬神經(jīng)元后LDH水平(P0.01)及細(xì)胞凋亡(P0.001)水平下降;(2)Western blot結(jié)果顯示:在氧糖剝奪后,BMSCs及海馬神經(jīng)元中HIF-1α蛋白水平(P0.01)及PTEN蛋白水平(P0.05)均增高,p-PTEN蛋白表達(dá)下降(P0.01);HIF-1α抑制劑2ME-2預(yù)處理BMSCs后PTEN蛋白水平(P0.05)增高,p-PTEN蛋白表達(dá)下降(P0.05);與BMSCs分離共培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元HIF-1α蛋白水平(P0.01)及PTEN蛋白水平(P0.001)下降,而HIF-1α抑制劑2ME-2預(yù)處理后PTEN蛋白水平(P0.05)增高,PTEN抑制劑bpV預(yù)處理氧糖剝奪海馬神經(jīng)元后p-PTEN蛋白表達(dá)增高(P0.05);(3)采用ELISA探討B(tài)MSCs培養(yǎng)基中生長因子的分泌情況,氧糖剝奪后VEGF水平升高(P0.001),加入HIF-1α抑制劑后水平下降(P0.001),且CoCl_2組水平較OGD組VEGF水平無統(tǒng)計學(xué)差異;(4)ChIP-qPCR結(jié)果提示BMSCs及海馬神經(jīng)元中HIF-1α蛋白可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并富集于PTEN基因啟動子區(qū)域,且OGD組富集倍數(shù)較Control組顯著升高(P0.001);(5)免疫共沉淀結(jié)果顯示BMSCs及海馬神經(jīng)元各組中HIF-1α和PTEN在蛋白質(zhì)水平無直接結(jié)合。結(jié)論:(1)缺氧條件下BMSCs可通過其旁分泌效應(yīng)保護(hù)受損神經(jīng)元,降低神經(jīng)元細(xì)胞損傷及凋亡水平;(2)HIF-1α激活、PTEN被抑制參與BMSCs對神經(jīng)元OGD損傷后的保護(hù)作用且HIF-1α被抑制時PTEN蛋白表達(dá)增高;(3)BMSCs及海馬神經(jīng)元中HIF-1α蛋白可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并富集在PTEN基因啟動子區(qū)域負(fù)性調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄過程。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R722.1
【圖文】：

技術(shù)路線Fig.1Technicalroute

圖 1 光鏡下觀察 BMSCs 與海馬神經(jīng)元 OGD 損傷前后細(xì)胞形態(tài)（20×）Fig.1 Observation of cell morphology of BMSCs and hippocampal neurons before and afterOGD injury under light microscopic(20×)3.2 25uM bpV 為海馬神經(jīng)元 OGD 損傷后培養(yǎng) 24h 條件下抑制 PTEN

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 周云英;劉華;郭銳翰;楊龍艷;卞偉華;賀俊崎;;缺氧影響PTEN磷酸化和核定位[J];首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2011年02期

2 尹曉慧;齊素華;許靜;韓東;張光毅;;PTEN抑制劑保護(hù)缺血神經(jīng)元機(jī)制的研究[J];徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2007年05期

本文編號：2713903