【摘要】：第一部分驚厥持續(xù)狀態(tài)后不同時(shí)期不同發(fā)育期腦內(nèi)海馬神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)的變化目的:探索幼年鼠及成年鼠驚厥持續(xù)狀態(tài)(Status Convulsion,SC)后不同時(shí)期海馬內(nèi)神經(jīng)環(huán)路中神經(jīng)元髓鞘、軸突及突觸的動(dòng)態(tài)變化。方法:選用Sprague Dawley(SD)幼年鼠(生后21天齡[P21])及成年鼠(生后60天齡[P60]分為正常對(duì)照組和SC模型組。SC模型組采用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射誘導(dǎo)SC;采用電鏡觀察SC后不同時(shí)期髓鞘、突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,Western blotting檢測(cè)SC后不同時(shí)期大鼠海馬髓鞘堿性蛋白MBP、軸突生長(zhǎng)抑制因子(Nogo A、OMgp、MAG)、突觸囊泡蛋白(SYP)、AMPA受體各亞基、Lingo-1蛋白的表達(dá)變化;免疫熒光檢測(cè)Lingo-1蛋白表達(dá)變化;以及比較SC所致的髓鞘、軸突及突觸損傷在不同發(fā)育期腦內(nèi)的差異。結(jié)果:(1)海馬髓鞘自SC后1天開(kāi)始即出現(xiàn)腫脹、分層,而后出現(xiàn)塌陷、空泡化,持續(xù)至SC后60天,且同時(shí)伴隨髓鞘厚度及髓鞘蛋白MBP表達(dá)減少(P0.05)。(2)幼年鼠及成年鼠SC后20天海馬內(nèi)NF200陽(yáng)性纖維數(shù)量減少且長(zhǎng)度縮短(P0.05);同時(shí)SC后不同時(shí)期幼年鼠海馬中OMgp和MAG表達(dá)有不同程度的增加,而成年鼠海馬中OMgp表達(dá)明顯增加(P0.05)。(3)與同齡正常對(duì)照組相比,幼年鼠SC后20天海馬CA1區(qū)突觸數(shù)目減少(P0.05),突觸前膜活性帶長(zhǎng)度增加(P0.05),而突觸后膜PSD厚度下降(P0.05);幼年鼠SC后1天SYP蛋白表達(dá)減少,SC后20天及60天表達(dá)增加(P0.05),而成年鼠SC后各個(gè)時(shí)期SYP蛋白表達(dá)持續(xù)減少(P0.05)。(4)幼年鼠SC后AMPA受體亞基以Glu R1/4亞基組成為主,其中Glu R2亞基SC后1天減少,而后短暫增加,至SC后60天減少(P0.05);而在成年鼠SC后AMPA受體亞基以Glu R1/3亞基組成為主,Glu R2亞基SC后呈持續(xù)減少(P0.05)。(5)幼年鼠及成年鼠海馬內(nèi)Lingo-1蛋白表在SC后5天開(kāi)始增加持續(xù)至SC后60天(P0.05)。結(jié)論:SC后幼年鼠和成年鼠海馬神經(jīng)環(huán)路中的神經(jīng)纖維髓鞘、軸突及突觸結(jié)構(gòu)均受到不同程度的損傷;Lingo-1信號(hào)可能參與了SC所致腦損傷病理過(guò)程;幼年鼠與成年鼠SC后髓鞘損傷程度及突觸數(shù)目改變存在年齡差異,幼年鼠對(duì)SC所致髓鞘及突觸損傷較成年鼠耐受性好。第二部分Lingo-1 shRNA慢病毒載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染動(dòng)物模型驗(yàn)證目的:分別構(gòu)建抑制或促進(jìn)Lingo-1蛋白表達(dá)的shRNA慢病毒載體,并驗(yàn)證相應(yīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)染至大鼠腦內(nèi)后的功能。方法:分別構(gòu)建抑制或促進(jìn)Lingo-1蛋白表達(dá)的shRNA慢病毒載體。選用的幼年及成年SD大鼠,首先采用免疫熒光檢測(cè)經(jīng)側(cè)腦室注射轉(zhuǎn)染至腦內(nèi)后慢病毒GFP表達(dá)分布情況;其次根據(jù)病毒滴度測(cè)定結(jié)果分別設(shè)置三個(gè)劑量等級(jí),分別轉(zhuǎn)染幼年鼠和成年鼠,通過(guò)western blotting檢測(cè)病毒載體轉(zhuǎn)染后海馬內(nèi)Lingo-1蛋白表達(dá)情況,篩選Lingo-1過(guò)表達(dá)慢病毒(OLV)最優(yōu)干預(yù)劑量;最后,根據(jù)抑制及促進(jìn)Lingo-1蛋白表達(dá)的shRNA慢病毒載體最優(yōu)干預(yù)劑量,分別轉(zhuǎn)染至大鼠腦內(nèi),并采用Western blotting分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后3天、7天、14天、28天大鼠海馬內(nèi)Lingo-1蛋白表達(dá)情況,驗(yàn)證各類(lèi)病毒對(duì)Lingo-1蛋白表達(dá)的作用及選擇最優(yōu)干預(yù)時(shí)間。結(jié)果:(1)所使用慢病毒載體的滴度分別為抑制Lingo-1表達(dá)慢病毒載體(LV):1E+9TU/ml,Lingo1過(guò)表達(dá)慢病毒載體(OLV):1E+8TU/ml,陰性對(duì)照慢病毒載體(NC):5E+8TU/ml。(2)慢病毒載體能夠經(jīng)腦立體定位側(cè)腦室注射成功轉(zhuǎn)染至腦內(nèi)后,且能在腦內(nèi)擴(kuò)布并感染皮層及海馬細(xì)胞,持續(xù)時(shí)間至少為28天。(3)Lingo1過(guò)表達(dá)慢病毒載體對(duì)幼年鼠及成年鼠最優(yōu)干預(yù)劑量分別為:5μl/只、8μl/只;抑制Lingo-1表達(dá)慢病毒載體對(duì)幼年鼠及成年鼠最優(yōu)干預(yù)劑量參照課題組前期實(shí)驗(yàn)分別設(shè)定為:1.5μl/只、3μl/只;陰性對(duì)照病毒為:2.5μl/只、5μl/只。(4)采用分別最優(yōu)劑量慢病毒載體干預(yù)后,抑制或促進(jìn)Lingo-1表達(dá)慢病毒均分別在7天、14天、28天對(duì)海馬內(nèi)Lingo-1蛋白表達(dá)產(chǎn)生明顯抑制或促進(jìn)作用(P0.05)。結(jié)論:所構(gòu)建慢病毒載體經(jīng)側(cè)腦室注射轉(zhuǎn)染至腦內(nèi)后對(duì)海馬Lingo-1蛋白表達(dá)能達(dá)到預(yù)期效果。第三部分抑制或促進(jìn)Lingo-1基因表達(dá)對(duì)驚厥持續(xù)狀態(tài)后海馬異常神經(jīng)環(huán)路形成的影響目的:探討調(diào)控Lingo-1表達(dá)能否影響SC所致髓鞘、軸突、突觸損傷,及影響癲癇發(fā)生。方法:以第一部分實(shí)驗(yàn)大鼠作為慢病毒未干預(yù)組(NI),包括2個(gè)亞組即正常對(duì)照組(NI-Control)和SC模型組(NI-SC)。另外再重新選用15天齡大鼠和54天齡大鼠分別予以慢病毒干預(yù),根據(jù)干預(yù)慢病毒類(lèi)型不同分為:NC病毒干預(yù)組(NC)、LV病毒干預(yù)組(LV)、OLV病毒干預(yù)組(OLV)。各個(gè)大組分別分為2個(gè)亞組,其中一個(gè)作為對(duì)照組,另一個(gè)組采用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射誘導(dǎo)SC作為SC模型組。比較不同慢病毒干預(yù)對(duì)腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品SC誘導(dǎo)潛伏期的差異;采用電鏡觀察SC后不同時(shí)期髓鞘、突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,Western blotting檢測(cè)SC后不同時(shí)期大鼠海馬髓鞘堿性蛋白MBP、軸突生長(zhǎng)抑制因子(Nogo A、OMgp、MAG)、突觸囊泡蛋白(SYP)、AMPA受體Glu R2亞基、Lingo-1蛋白的表達(dá)變化;Timm染色觀察苔蘚纖維芽生;以及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)SC后不同時(shí)期各組大鼠腦電活動(dòng)變化情況。結(jié)果:(1)幼年鼠及成年鼠不同慢病毒干預(yù)組驚厥潛伏期較同齡未干預(yù)組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但幼年鼠與成年鼠相同干預(yù)組間相比,幼年鼠的驚厥潛伏期更短。(2)抑制Lingo-1蛋白表達(dá)后能有效增加有髓神經(jīng)元髓鞘厚度,并減輕SC所致髓鞘損害減輕(P0.05)。促進(jìn)Lingo-1表達(dá)后將減小有髓神經(jīng)元髓鞘厚度,且SC后仍遺留嚴(yán)重髓鞘損害(P0.05)。(3)抑制Lingo-1蛋白表達(dá)后能夠明顯增加幼年鼠及成年鼠海馬內(nèi)MBP表達(dá)水平,并削弱SC對(duì)MBP表達(dá)的影響(P0.05)。促進(jìn)Lingo-1表達(dá)后將減少幼年鼠及成年鼠海馬內(nèi)MBP表達(dá)水平,且SC后MBP表達(dá)仍維持較低水平(P0.05)。(4)Timm染色結(jié)果顯示抑制Lingo-1表達(dá)后能夠顯著減少幼年鼠及成年鼠SC后20天海馬CA3區(qū)MFS的發(fā)生(P0.05);促進(jìn)Lingo-1表達(dá)對(duì)幼年鼠及成年鼠SC后海馬CA3區(qū)MFS發(fā)生無(wú)顯著影響(P0.05);且正常情況下隨著年齡增加,CA3區(qū)苔蘚纖維顆粒逐漸增加,SC后成年鼠海馬CA3區(qū)苔蘚纖維芽生均較幼年鼠明顯。(5)抑制Lingo-1表達(dá)或促進(jìn)Lingo-1表達(dá)后幼年鼠海馬內(nèi)軸突生長(zhǎng)抑制因子(Nogo A、OMgp、MAG)表達(dá)均在SC后不同時(shí)期均有不同程度的減少(P0.05);而對(duì)成年鼠主要為OMgp表達(dá)在SC后60天減少(P0.05)。(6)抑制或促進(jìn)Lingo-1表達(dá)均能使SC后20天海馬CA1區(qū)突觸數(shù)目增加。(7)抑制Lingo-1表達(dá)能改善SC后20天海馬突觸PSD厚度的減小(P0.05)。促進(jìn)Lingo-1表達(dá)將導(dǎo)致SC后海馬CA1區(qū)突觸PSD厚度及活性帶長(zhǎng)度均減小(P0.05)。(8)抑制Lingo-1表達(dá)能改善幼年鼠海馬內(nèi)SC所致SYP表達(dá)改變(P0.05),但對(duì)成年鼠SC后SYP表達(dá)無(wú)顯著影響(P0.05)。促進(jìn)Lingo-1表達(dá)能夠顯著抑制幼年鼠海馬內(nèi)SC后各個(gè)時(shí)期SYP的表達(dá)(P0.05),而促進(jìn)成年鼠SC后海馬內(nèi)SYP表達(dá)(P0.05)。(9)抑制Lingo-1表達(dá)將抑制幼年鼠SC后Glu R2表達(dá)(P0.05),促進(jìn)成年鼠SC后60天Glu R2的表達(dá)(P0.05);促進(jìn)Lingo-1表達(dá)將增加幼年鼠SC后60天Glu R2表達(dá)(P0.05),而減少成年鼠SC后60天Glu R2亞基表達(dá)(P0.05)。(10)腦電圖動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示抑制Lingo-1表達(dá)能夠減輕SC后20天EEG癇性放電的嚴(yán)重程度(P0.05),但是對(duì)癇性放電發(fā)生次數(shù)無(wú)明顯影響;促進(jìn)Lingo-1的表達(dá)對(duì)SC后EEG癇性放電無(wú)明顯改善但也無(wú)顯著加重(P0.05)。結(jié)論:抑制Lingo-1表達(dá)能夠改善不同發(fā)育期腦SC所致髓鞘、軸突及突觸超微結(jié)構(gòu)損害;促進(jìn)Lingo-1表達(dá)對(duì)不同發(fā)育期腦SC所致髓鞘、軸突及突觸超微結(jié)構(gòu)損害無(wú)顯著影響;抑制或促進(jìn)Lingo-1表達(dá)均不能改變SC后腦電圖癇性放電的次數(shù),但是抑制Lingo-1表達(dá)能夠減輕腦電圖癇性放電的嚴(yán)重程度。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R720.597

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡越;蔣莉;李欣;張曉萍;;持續(xù)驚厥后影響海馬神經(jīng)元凋亡的相關(guān)因素[J];中華神經(jīng)科雜志;2006年01期

本文編號(hào)：2713186