【摘要】： 【背景】 1.關于多溴聯(lián)苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers ,PBDEs) PBDEs是一系列含溴原子的芳香族化合物。根據(jù)苯環(huán)上溴原子的個數(shù)和位置的不同,多溴聯(lián)苯醚總共有209種同分異構體。其最大的用途是作為阻燃劑,已被廣泛用于電子電器設備、自動控制設備,建筑材料和紡織品等商品化產品。由于PBDEs環(huán)境中不易分解可形成持續(xù)性的有機污染物、并具有高親脂性、生物累積及生物放大效應等特性�？赏ㄟ^食物、母乳及呼吸途徑進入生物體內,對環(huán)境和人體造成巨大的潛伏性的危害。故有專家稱之為“化學定時炸彈”。 由PBDEs化學結構與早就臭名昭著的多氯聯(lián)苯(PCB)及甲狀腺激素相似,其實,自開始使用至今,PBDEs對人體健康的潛在不良因素影響一直受到研究者的關注;以往研究證實低溴PBDES可導致甲狀腺素分泌紊亂、神經行為改變以及誘發(fā)惡性腫瘤,由于其親脂\及化學結構與甲狀腺激素的類似,其對生物毒性作用最受人關注的就是發(fā)育的神經毒性。研究者對發(fā)育神經毒性的關注依據(jù)主要來源于以下幾個方面發(fā)現(xiàn):1)孕期或產后的PBDEs暴露的動物實驗,能夠造成動物的長期行為改變,尤其是指運動活動及認知活動及記憶能力。2)PBDEs會影響甲狀腺的內環(huán)境穩(wěn)定,進而導致發(fā)育神經的毒性。3)研究表明年幼的動物對于PBDEs的排泄能力比成年的動物差,并且在年幼的動物體內(包括腦組織)檢測的PBDEs濃度比成年的動物高。4)PBDEs能夠通過乳汁排泄,在北美發(fā)現(xiàn)相當高的濃度。5)粉塵是PBDEs暴露的一個主要來源。因此,在美國以及歐洲等地,低溴類如BDE-47,99,153等相繼被限制生產及使用。 2.關于十溴聯(lián)苯醚(Brominated Diphenyl Ethers-209 ,BDE-209) BDE-209為PBDEs的高溴類化合物,是一種含十個溴原子的高溴多溴聯(lián)苯醚,由于其具有添加量少而熱穩(wěn)定性好,價格便宜等優(yōu)勢,目前應用最廣泛。由于用量多\用途廣,推測環(huán)境中濃度高\生物蓄積量大,BDE-209在生物體中的濃度還將繼續(xù)升高。由于BDE-209的高親脂性,易通過血腦屏障,有研究者認為BDE-209在圍產期暴露可以導致仔鼠成年后的自發(fā)行為以及學習記憶能力的影響。研究也證明BDE-209具有神經發(fā)育毒性,免疫毒性,內分泌毒性以及致癌性等。但也有學者認為BDE-209在體內的代謝快,蓄積低,在常規(guī)暴露水平下對機體不造成影響。由于研究結果不一致,故研究BDE-209的生物毒性是很有必要的。 3.關于N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC) NAC可提高機體內的谷胱甘肽(glutathion, GSH)含量。NAC作為小分子物質,易于進入細胞,脫乙�；蟪蔀镚SH合成的前體,促進GSH的合成,提高組織內GSH含量,增強組織的抗自由基及藥物和毒物損傷能力。GSH是由谷氨酸,半胱氨酸和甘氨酸結合而成的三肽,半胱氨酸上的巰基是其活性基團, GSH具有解毒、抗氧化等多種重要功能。體內和體外的實驗證據(jù)均提示NAC能提高細胞內GSH的生物合成。NAC提高體內GSH含量的作用可以解釋其在多種疾病過程中的保護作用。很多體內和體外的研究表明NAC能夠抑制多種毒物的氧化應激作用,從而減輕細胞或組織的凋亡及損傷。 我們前期實驗結果已證實,孕哺期母鼠BDE-209暴露可導致仔鼠神經系統(tǒng)發(fā)育異常,出現(xiàn)學習與記憶力障礙,而對其機制的進一步研究提示可能與氧化應激反應增強、細胞凋亡增加有關。本研究將在前期研究基礎上,本課題從細胞分子水平,用BDE-209對新生鼠海馬神經元細胞進行染毒,并觀察NAC減少其毒性作用,光鏡觀察神經元細胞的形態(tài)與突觸發(fā)育情況,通過檢測神經細胞存活率、細胞凋亡率、P38MAPK的表達、Ca2+含量、ROS氧化應激指標,初步探討B(tài)DE-209的神經毒性作用機制及N-乙酰半胱氨酸的干預效果。本課題分為以下四個部分進行各項具體實驗。 第一部分 N-乙酰半胱氨酸對BDE-209誘導原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經元細胞損傷的影響及相關機制研究 【目的】 取新生SD大鼠(一天內)的海馬組織進行原代神經元細胞培養(yǎng),鑒別神經元的純度,觀察BDE-209對原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經元細胞形態(tài)結構及細胞存活率的影響。 【材料與方法】 1.購買新生SD大鼠(一天內),取新生鼠海馬組織進行原代神經元細胞培養(yǎng)。 2.培養(yǎng)7天后海馬神經元細胞進行神經元細胞純度鑒別。 3.原代培養(yǎng)7d的新生鼠海馬神經細胞暴露于BDE-209,實驗共分10組,即空白對照組、DMSO對照組、NAC對照組、NAC+DMSO對照組、實驗A、B、C、D、E、F組(BDE-209 10 ug/ml、BDE-209 30 ug/ml、BDE-209 50.0 ug/ml、BDE-209 10 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 30 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 50.0 ug/ml +NAC 0.1 mmol/l)。每組設3個平行樣。DMSO對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液,NAC對照組加入含0.1 mmol/l NAC的培養(yǎng)液。24h后,在倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)觀察。 4. MTT比色分析檢測神經元的存活率。 【結果】 1.原代海馬神經元細胞培養(yǎng)第7天觀察神經元胞體清晰明亮,呈明顯凸起狀,周圍暈光明顯,胞核及核仁清晰可見,突起變粗變長并有分支,邊緣清晰,形成明顯的神經網絡。 2.免疫細胞化學法NeuN鑒定神經元的經典方法。由結果可見分散的海馬神經元,神經元是主體,可占95%。 3.倒置顯微鏡觀察不同劑量組神經元細胞形態(tài),實驗組可見神經元細胞胞體變小,變形,細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,隨著BDE-209濃度加大,發(fā)泡現(xiàn)象明顯,其神經突起出現(xiàn)縮短。高劑量實驗B、C組可見神經細胞膜不完整,皺縮,空泡明顯,大量細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落,突起縮短甚至消失。NAC干預組可使細胞發(fā)泡現(xiàn)象明顯減少。 4. MTT檢測海馬神經元細胞存活率: DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的細胞存活率分別為:99%、98%及92%,尚不能認為Blank control的細胞存活率與DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的細胞存活率有差別(P0.05)。實驗A、B、C組的細胞存活率分別為: 82%、54%、49%,Blank control的細胞存活率與實驗A、B、C組(BDE-209 10 ,30, 50 ug/ml)的細胞存活率有差別(P0.01),實驗A組與實驗B、C組比較(P0.01),即隨BDE-209濃度增加,細胞存活率有隨之下降。加入0.1 mmol/l NAC的實驗D、E、F組的細胞存活率分別為:82%、71%、68%,實驗D組與實驗A組比較(P0.05),實驗E組與實驗B組比較(P0.01),實驗F組與實驗C組比較(P0.01),即同時加入0.1 mmol/l NAC能夠減輕BDE-209導致的海馬神經細胞的損傷。 【結論】 BDE-209(10ug/ml,30ug/ml,50ug/ml)作用24小時,均可致培養(yǎng)7d的新生鼠海馬神經細胞的損傷。觀察到海馬神經細胞及突觸結構發(fā)生改變;隨BDE-209濃度增加,細胞存活率有不同程度的下降。NAC(0.1mmol/l)同時作用24小時,可減輕細胞的損傷,提高細胞存活率。 第二部分 N-乙酰半胱氨酸對BDE-209誘導原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經元細胞的凋亡及P38MAPK的表達研究 【目的】 觀察BDE-209染毒原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經元細胞的凋亡及P38MAPK的表達,以及NAC的干預效果。 【材料與方法】 1.原代培養(yǎng)7d的新生鼠海馬神經細胞暴露于BDE-209,實驗共分10組,即空白對照組、DMSO對照組、NAC對照組、NAC+DMSO對照組、實驗A、B、C、D、E、F組(BDE-209 10 ug/ml、BDE-209 30 ug/ml、BDE-209 50.0 ug/ml、BDE-209 10 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 30 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 50.0 ug/ml +NAC 0.1 mmol/l)。每組設3個平行樣。DMSO對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液,NAC對照組加入含0.1 mmol/l NAC的培養(yǎng)液。 2.采用流式細胞術Annexin V/PI檢測海馬神經細胞凋亡。 3.激光共聚焦掃描顯微鏡免疫熒光檢測海馬神經細胞凋亡P38MAPK的表達。 【結果】 1.流式細胞儀FITC-Annexin V/PI法檢測BDE-209誘導海馬神經細胞凋亡: Blank control海馬神經細胞凋亡率2.35%。DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的細胞凋亡率分別為:2.58%、2.91%及3.70%,尚不能認為Blank control的細胞凋亡率與DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的細胞凋亡率有差別(P0.05)。實驗A、B、C組的細胞凋亡率分別為:8.28%、20.28%和29.81%,Blank control的細胞凋亡率與實驗A、B、C組(BDE-209 10 ,30, 50 ug/ml)的細胞存活率有差別(P0.01),實驗A組與實驗B、C組比較(P0.01),實驗B組與實驗C組比較(P0.01),即隨BDE-209濃度增加,細胞凋亡率有隨之升高。加入0.1 mmol/l NAC的實驗D、E、F組的細胞凋亡率分別為:4.72%、7.71%、11.08%,實驗D組與實驗A組比較(P0.01),實驗E組與實驗B組比較(P0.01),實驗F組與實驗F組比較(P0.01),即同時加入0.1 mmol/l NAC能夠減輕BDE-209誘導海馬神經細胞的凋亡。 2.激光共聚焦掃描顯微鏡免疫熒光檢測海馬神經細胞凋亡P38MAPK的表達: 免疫熒光和圖像分析顯示正常海馬神經細胞胞漿P38MAPK弱表達,其熒光強度為: 1.38±0.31,DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的P38MAPK的表達熒光強度分別為:1.47、1.48及1.85,尚不能認為Blank control的P38MAPK的表達與DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的P38MAPK的表達有差別(P0.05)。實驗A、B、C組的P38MAPK的表達熒光強度分別為:3.20、6.07和8.71, Blank control的P38MAPK的表達與實驗A、B、C組(BDE-209 10 ,30, 50 ug/ml)的P38MAPK的表達有差別(P0.01),實驗A組與實驗B、C組比較(P0.01),實驗B組與實驗C組比較(P0.01),即隨BDE-209濃度增加,P38MAPK表達上調。加入0.1 mmol/l NAC的實驗D、E、F組的P38MAPK的表達分別為:2.88、3.01、3.57,實驗D組與實驗A組比較(P0.05),實驗E組與實驗B組比較(P0.01),實驗F組與實驗F組比較(P0.01),即同時加入0.1 mmol/l NAC能夠減輕BDE-209誘導海馬神經細胞的P38MAPK的表達。 【結論】 BDE-209(10ug/ml,30ug/ml,50ug/ml)作用24小時,均可致海馬神經細胞的凋亡。BDE-209可通過影響調亡信號P-P38MAPK的表達,誘導海馬神經元細胞調亡。NAC(0.1mmol/l)同時作用24小時,可抑制神經元細胞的P-P38MAPK的表達,減輕海馬神經元細胞調亡。 第三部分N-乙酰半胱氨酸對BDE-209誘導原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經元細胞ROS的研究 【目的】 觀察BDE-209對原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經元細胞內活性氧族(Reactive Oxygen Species ,ROS)含量的影響,以及NAC的干預效果。 【材料與方法】 1.原代培養(yǎng)7d的新生鼠海馬神經細胞暴露于BDE-209,實驗共分10組,即空白對照組、DMSO對照組、NAC對照組、NAC+DMSO對照組、實驗A、B、C、D、E、F組(BDE-209 10 ug/ml、BDE-209 30 ug/ml、BDE-209 50.0 ug/ml、BDE-209 10 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 30 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 50.0 ug/ml +NAC 0.1 mmol/l)。每組設3個平行樣。DMSO對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液,NAC對照組加入含0.1 mmol/l NAC的培養(yǎng)液。 2.激光共聚焦掃描顯微鏡免疫熒光檢測海馬神經細胞ROS熒光強度。 【結果】 激光共聚焦掃描顯微鏡免疫熒光檢測海馬神經細胞ROS的表達: 免疫熒光和圖像分析顯示正常海馬神經細胞ROS弱表達,其熒光強度為: 5.38,DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的ROS的表達熒光強度分別為:5.33、5.26及5.39,尚不能認為Blank control的ROS的表達與DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的ROS的表達有差別(P0.05)。實驗A、B、C組的ROS的表達分別為:15.27、18.96和24.53,Blank control的ROS的表達與實驗A、B、C組(BDE-209 10 ,30, 50 ug/ml)的ROS的表達有差別(P0.01),實驗A組與實驗B、C組比較(P0.01),實驗B組與實驗C組比較(P0.01),即隨BDE-209濃度增加,ROS的表達隨之升高。加入0.1 mmol/l NAC的實驗D、E、F組的P38MAPK的表達分別為:5.44、5.42、7.29,尚不能認為Blank control的ROS的表達與實驗D、E、F組的ROS的表達有差別(P0.05),即同時加入0.1 mmol/l NAC能夠減輕BDE-209誘導海馬神經細胞的ROS的表達。 【結論】 BDE-209(10ug/ml,30ug/ml,50ug/ml)作用24小時,均可使海馬神經細胞的ROS水平升高,可致海馬神經元細胞氧化應激損傷,這可能是BDE-209神經毒性的作用機制之一。NAC(0.1mmol/l)同時作用24小時,可以減輕海馬神經元細胞氧化應激損傷。 第四部分 N-乙酰半胱氨酸對BDE-209誘導原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經元細胞鈣超載的研究 【目的】 觀察BDE-209對原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經元細胞內Ca2+超載,以及NAC的干預效果。 【材料與方法】 1.原代培養(yǎng)7d的新生鼠海馬神經細胞暴露于BDE-209,實驗共分10組,即空白對照組、DMSO對照組、NAC對照組、NAC+DMSO對照組、實驗A、B、C、D、E、F組(BDE-209 10 ug/ml、BDE-209 30 ug/ml、BDE-209 50.0 ug/ml、BDE-209 10 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 30 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 50.0 ug/ml +NAC 0.1 mmol/l)。每組設3個平行樣。DMSO對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液,NAC對照組加入含0.1 mmol/l NAC的培養(yǎng)液。 2.流式細胞儀檢測海馬神經細胞Ca2+含量變化。 【結果】 流式細胞儀檢測海馬神經細胞Ca2+含量:正常海馬神經細胞Ca2+含量為: 12.38, DMSO control、NAC control及NAC+DMSO control的Ca2+含量分別為:13.38、14.31及15.36,尚不能認為Blank control的Ca2+含量與DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的Ca2+含量有差別(P0.05)。實驗A、B、C組的Ca2+含量分別為:26.85、55.95及78.14, Blank control的Ca2+含量與實驗A、B、C組(BDE-209 10 ,30, 50 ug/ml)的Ca2+含量有差別(P0.01),實驗A組與實驗B、C組比較(P0.01),實驗B組與實驗C組比較(P0.01),即隨BDE-209濃度增加,Ca2+含量隨之升高。加入0.1 mmol/l NAC的實驗D、E、F組的P38MAPK的表達分別為:17.28、23.53及28.10,實驗D組與實驗A組比較(P0.01),實驗E組與實驗B組比較(P0.01),實驗F組與實驗C組比較(P0.01),即同時加入0.1 mmol/l NAC能夠減輕BDE-209誘導海馬神經細胞的鈣超載。 【結論】 BDE-209(10ug/ml,30ug/ml,50ug/ml)作用24小時,均可致海馬神經元細胞鈣超載,這可能是BDE-209神經毒性的作用機制之一。NAC(0.1mmol/l)同時作用24小時,可以減輕海馬神經元細胞鈣超載所致的損傷。
【圖文】：

圖 1 PBDEs、 PCBs 及甲狀腺激素分子結構相似學通式為：C12H(0～9)Br(10～1)0，其中氫原子和溴原子 1 所示。PBDEs 共有 209 種同系物，，主要包括十溴二苯醚(OBDPO)和五溴二苯醚(PBDPO)。PBDEs 具有高親脂性，水低，但易于在沉積物中積累等特性。PBDEs 在環(huán)境中相當主要 PBDEs 的基本性質見表 1[29]：

C組 F組圖 11表三 NAC 干預 BDE-209 染毒海馬神經細胞 P38MAPK 的表達分組 nX±SP 值Blank control 7 1.38±0.31DMSO control 7 1.47±0.28 0．78▲NAC control 7 1.48±0.35 0．80▲AC+DMSO control 7 1.85±0.74 0．54▲A 組 7 3.20±0.36 0．00※B 組 7 6.07±0.79 0．00※C 組 7 8.71±0.80 0．00※D 組 7 2.88±0.46 0．00※E 組 7 3.01±0.71 0．00※
【學位授予單位】：廣州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R722.1

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 周俊;陳敦金;廖秦平;余艷紅;;孕期、哺乳期暴露十溴聯(lián)苯醚對子代大鼠免疫功能的影響[J];南方醫(yī)科大學學報;2006年06期

2 朱大明,年冀,何志輝,張松川;電磁輻射環(huán)境的潛在致突變水平[J];環(huán)境監(jiān)測管理與技術;2005年01期

3 吳奇,劉俊茹,郝麗萍;不同類型移動電話的電磁輻射水平[J];環(huán)境與健康雜志;2002年03期

4 董紅燕,劉君卓,陳冠英;甲醛對豚鼠肺巨噬細胞DNA的損傷作用[J];環(huán)境與健康雜志;1998年06期

5 李雪梅,李振義,王曉紅;關于苯作業(yè)對女工健康影響的調查[J];黑龍江醫(yī)學;2001年06期

6 周啟星,孫鐵珩;污染生態(tài)化學:現(xiàn)狀與展望[J];應用生態(tài)學報;2000年05期

7 周啟星;污染土壤修復標準建立的方法體系研究[J];應用生態(tài)學報;2004年02期

8 陳敦金;余琳;廖秦平;屈委月;;母源性BDE-209胃灌后對子鼠學習記憶能力的影響以及血清BDE-209濃度的測定[J];中華圍產醫(yī)學雜志;2006年06期

9 許宏霞,許國華,丁寧,呂敬媛;苯及其同系物對女工月經狀況和妊娠結局的影響[J];中國誤診學雜志;2002年02期

10 劉欣燕;邊旭明;韓京秀;曹兆進;范光升;張超;張文麗;張淑珍;孫曉光;;早期自然流產孕婦生活環(huán)境中的危險因素[J];中國醫(yī)學科學院學報;2007年05期

本文編號：2710873