【摘要】： 目的: 應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells, NSCs)移植聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-Stimulating Factor, G-CSF)對新生大鼠缺氧缺血性腦病(Hypoxic Ischemic Encephalopathy, HIE)模型進(jìn)行治療,從整體水平、細(xì)胞水平、分子生物學(xué)水平觀察治療后的效果,為臨床更有效的治療新生兒缺氧缺血性腦病(Hypoxic-Ischemic Encephalopathy, HIE)提供理論基礎(chǔ)。 方法: 1. NSCs的制備及鑒定取人胚胎腦組織,培養(yǎng)獲取生長旺盛的NSCs球,分散制成含小細(xì)胞球的細(xì)胞懸液,加入50μg/ml的DAPI溶液標(biāo)記細(xì)胞核,待移植用。應(yīng)用免疫熒光方法,以抗-神經(jīng)巢蛋白(Nestin)鑒定細(xì)胞NSCs特性。誘導(dǎo)分化后,以抗β-Ⅲ-tubulin抗體鑒定神經(jīng)元,抗GFAP抗體鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞。 2.模型動物分組及G-CSF注射7日齡Wistar乳鼠,麻醉后雙重結(jié)扎并剪斷左側(cè)頸總動脈,恢復(fù)2～4小時后,放入8%O2+92%N2的容器中2.5小時,用水浴箱控制環(huán)境溫度在39℃左右。將存活動物隨機(jī)分為三組,HIE組(A組),NSCs移植組(B組),NSCs移植+G-CSF治療組(C組)。其中C組于建模完成后1h給予G-CSF,注射劑量為50μg·(kg·d)-1,每天一次,連續(xù)注射5天。 3. NSCs移植B組和C組動物在模型制作后第2天行NSCs移植,將幼鼠麻醉后固定在立體定向儀上,將制備好的NSCs(細(xì)胞濃度約為1×105/μL)懸液5μL勻速緩慢注入左側(cè)(損傷側(cè))側(cè)腦室,A組動物移植入等量生理鹽水。移植后不予免疫抑制劑。 4.行為學(xué)及解剖觀察建模完成后以及設(shè)定時間點(diǎn)對各組大鼠進(jìn)行mNSS評分,并對各組大鼠大腦重量進(jìn)行測定,行TTC染色,比較大腦梗死灶。 5.組織檢測設(shè)定時間點(diǎn)將各組大鼠斷頭取腦,按實驗內(nèi)容不同分別制作石蠟、冰凍切片,行HE及Nissl染色,觀察大腦神經(jīng)元的損傷情況,應(yīng)用免疫熒光方法檢測植入細(xì)胞存活、遷移、分化情況。通過圖像處理軟件進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)及統(tǒng)計學(xué)分析,對比B組和C組植入細(xì)胞存活、遷移、分化情況。 結(jié)果: 1. NSCs的鑒定人胎腦組織分離的細(xì)胞體外培養(yǎng)獲取生長旺盛的干細(xì)胞球,免疫熒光標(biāo)記后,大部分細(xì)胞表達(dá)NSCs標(biāo)志Nestin,誘導(dǎo)分化后,對分化細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物β-Ⅲ-tubulin、GFAP的鑒定,證明所獲細(xì)胞具有NSCs特性,且DAPI標(biāo)記后不影響其活性。 2. NSCs移植移植后可見DAPI陽性的植入細(xì)胞存活,并向周圍擴(kuò)散,分布集中在海馬、額葉皮層、腦干和小腦,細(xì)胞形態(tài)與所處腦組織部位的細(xì)胞形態(tài)相似。 3. mNSS評分建模完成后所有大鼠的mNSS評分較高。NSCs移植后,移植組評分較對照組明顯降低,且C組評分較B組評分明顯減低,表明經(jīng)聯(lián)合治療后大鼠的運(yùn)動行為能力有所改善。 4.解剖學(xué)NSCs移植后1周和2周大腦重量明顯高于A組(F值分別為42.38和121.76,P0.01),且C組大腦重量明顯高于B組(t值分別為2.36和2.63, P0.05);NSCs移植后4周大腦重量明顯高于A組(F=58.22,P0.01),B組和C組比較無顯著性差異。TTC染色顯示移植后C組梗死灶體積較A組減小。 5. HE染色及尼氏染色移植后2周,A組皮層神經(jīng)元及海馬錐體細(xì)胞變性壞死,細(xì)胞呈空泡狀,尼氏小體缺失;B組病理變化較A組輕,細(xì)胞排列較有序,仍可見斑點(diǎn)狀神經(jīng)元變性、壞死;而C組細(xì)胞排列相對整齊,形態(tài)較規(guī)則,未見變性壞死的神經(jīng)細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)布滿深藍(lán)色尼氏小體。 6. TUNEL檢測NSCs移植術(shù)后3天,B組大腦皮層見大量的植入細(xì)胞處于凋亡狀態(tài),而C組的植入細(xì)胞凋亡明顯減少(181.07±14.16/20倍視野VS 73.20±14.01/20倍視野),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=68.37,P0.01)。 7.免疫熒光NSCs移植術(shù)后1、2、4周觀察B組和C組大腦組織中植入細(xì)胞。 ①通過DAPI檢測到植入細(xì)胞從腦室向外遷移,損傷側(cè)可見DAPI陽性細(xì)胞存在,以額葉皮層和海馬多見,紋狀體及顳葉皮層亦有少許植入細(xì)胞分布。B組的陽性細(xì)胞數(shù)少于C組(726.31±142.33/mm2 VS 851.04±105.75/mm2),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.07,P0.01 )。植入后2周,更多的移植細(xì)胞到達(dá)損傷區(qū),B組植入細(xì)胞數(shù)仍少于C組(923.45±121.49/mm2 VS 944.64±117.55/mm2),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.5,P0.05)。植入后4周,2組細(xì)胞數(shù)量均有所減少,細(xì)胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.47,P0.05)。 ②通過DAPI+β-Ⅲ-tubulin雙標(biāo)檢測到植入細(xì)胞分化成的神經(jīng)元。其分布以皮層、海馬為主。移植后1周,皮層部位兩組植入細(xì)胞分化的神經(jīng)元數(shù)量上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.66,P0.05)。而海馬各區(qū)主要位于顆粒細(xì)胞層,C組神經(jīng)元分化存活數(shù)量較B組多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.02,P0.01)。移植后2周,皮層及海馬C組神經(jīng)元分化存活數(shù)量較B組多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為4.78和2.87,P0.01)。 ③通過DAPI+GFAP雙標(biāo)檢測到植入細(xì)胞分化成的星形膠質(zhì)細(xì)胞。其數(shù)量較少,見于紋狀體、白質(zhì),皮層亦可見散在分布,移植后1周,C組植入細(xì)胞分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較B組多(53.57±18.22/mm2 VS 47.42±17.81/mm2),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.83,P0.01)。移植后2周,兩組植入細(xì)胞分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.59,P0.05)。 ④通過DAPI+Olig2雙標(biāo)檢測植入細(xì)胞分化成的少突膠質(zhì)細(xì)胞。NSCs植入側(cè)腦室后,幾乎不能分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞,偶可見到DAPI和Olig2雙陽性細(xì)胞,兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論: 1.人胎腦組織在體外含EGF和bFGF的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)可獲得NSCs球,具有NSCs特性,且DAPI標(biāo)記后不影響其活性。 2.移植至HIE大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞能存活、遷移并分化成神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞。 3. NSCs移植聯(lián)合G-CSF能更有效地促進(jìn)大腦重量增加,修復(fù)病理損傷,促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù),且植入細(xì)胞存活率及向神經(jīng)細(xì)胞分化的比率增加。
【圖文】：

胞體呈圓形或橢圓形的神經(jīng)元樣細(xì)胞；具有多個粗長突起的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。對分化細(xì)胞進(jìn)行類型鑒定，抗人-β-Ⅲ-tubulin 抗體鑒定神經(jīng)元，以 FITC 標(biāo)記胞漿呈綠色，抗人-GFAP 抗體鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞，，以 Dylight 標(biāo)記胞漿呈綠色，亦可見 DAPI 標(biāo)記的c d圖 1-a. 倒置顯微鏡下 NSCs 球（×200）Fig 1-a. NSCs sphere under microscope(×200)圖1-b. 免疫熒光染色示NSCs球Nestin染色呈陽性（×200）Fig 1-b. Nestin-positive NSCs sphere byimmunofluorescence(×200)

Fig 1-a. NSCs sphere under microscope(×200)圖1-b. 免疫熒光染色示NSCs球Nestin染色呈陽性（×200）Fig 1-b. Nestin-positive NSCs sphere byimmunofluorescence(×200)圖1-c. 倒置顯微鏡下NSCs誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞球貼壁，周緣的細(xì)胞伸出較多突起(×400).Fig1-c. NSCs with enations afterdifferentiation inducing (×400)圖1-d免疫熒光染色示NSCs誘導(dǎo)分化后，β-Ⅲ-tubulin 標(biāo)記的神經(jīng)元，細(xì)胞核DAPI標(biāo)記呈藍(lán)色，胞體及軸突呈綠色（×400）Fig 1-d. β - Ⅲ -tubulin-positive neuronsafter differentiation inducing, with blue
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 屈素清,欒佐,尹國才,郭萬里,胡曉紅,吳南海,閆鳳青,錢陽明;新生鼠缺氧缺血性腦損傷后經(jīng)腦室人神經(jīng)干細(xì)胞移植的實驗研究[J];中華兒科雜志;2005年08期

2 欒佐,尹國才,胡曉紅,屈素清,吳南海,嚴(yán)鳳清,錢陽明,金慧玉,龔曉軍;人神經(jīng)干細(xì)胞移植治療重度新生兒缺氧缺血性腦病一例[J];中華兒科雜志;2005年08期

本文編號：2710542