發(fā)布時間：2020-06-13 03:02

【摘要】： 第一部分斑馬魚tbx2基因在心臟發(fā)育中的時空表達譜分析 目的tbx2基因是T-box(Tbx，T盒)轉(zhuǎn)錄因子基因家族的成員之一，表達于胚胎發(fā)生中的多個組織和器官。在鼠的心臟發(fā)育中，表達于相對于非室腔心肌帶的流出道、內(nèi)彎、房室管和流入道。斑馬魚是研究心臟發(fā)育的理想模式生物，tbx2基因在斑馬魚心臟發(fā)育中的作用研究目前尚未見報道，作為探索tbx2基因功能的第一步，我們描繪了tbx2基因在心臟發(fā)育中的時空表達譜。 方法體外轉(zhuǎn)錄地高辛標(biāo)記的反義tbx2 RNA探針，收集斑馬魚心臟發(fā)育相關(guān)時期的胚胎，進行整胚原位雜交。 結(jié)果tbx2在心臟中的表達首先發(fā)生于5體節(jié)期的前側(cè)中胚層的兩側(cè)區(qū)域，受精后24小時(hpf)，表達于原始的心管，隨后隨著心管的發(fā)育，心房心室的形成，除了預(yù)期房室交界處外，逐漸在心管的大部分消失，36hpf后逐漸局限于房室管，96hpf表達消失。 結(jié)論整胚原位雜交是研究斑馬魚特定基因時空表達的良好方法。tbx2在斑馬魚心臟發(fā)育中的表達模式提示了tbx2可能與心臟房室的分化和房室管的形成有關(guān)；與鼠胚表達譜的對比說明了tbx2基因進化上時空表達譜的高度保守性，并且探測到tbx2在斑馬魚心臟發(fā)育中的最初表達早于鼠胚的心臟，提示tbx2基因?qū)Π唏R魚心臟發(fā)育的調(diào)節(jié)作用可能早于對鼠類心臟發(fā)育的影響。 第二部分斑馬魚tbx2基因阻抑和過表達心臟發(fā)育的表型研究 目的在對斑馬魚tbx2基因心臟發(fā)育時空表達譜分析的基礎(chǔ)上，研究斑馬魚tbx2基因阻抑和基因過表達對心臟發(fā)育的影響，以說明tbx2基因在心臟發(fā)育中的作用。 方法嗎啉修飾的反義寡核苷酸(MO)是進行基因抑制的良好方法。設(shè)計tbx2-MO和對照MO(c-MO)，在斑馬魚受精卵的單細胞期，進行不同濃度的顯微注射，并通過熒光蛋白融合標(biāo)記實驗和tbx2-mRNA、tbx2-MO共注射拯救實驗，驗證tbx2-MO抑制tbx2基因表達的有效性和特異性；基因過表達是通過給斑馬魚受精卵注射體外合成的tbx2-mRNA，來研究tbx2基因功能獲得對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的影響。 結(jié)果熒光蛋白融合標(biāo)記實驗驗證了tbx2-MO可以很好得阻抑斑馬魚胚胎tbx2的表達，tbx2-MO組胚胎在心臟收縮性、節(jié)律和形態(tài)學(xué)發(fā)生上出現(xiàn)了異常，心臟畸形隨著注射劑量的增加而出現(xiàn)比較一致的表型，而c-MO組胚胎沒有出現(xiàn)明顯的畸形；tbx2-mRNA和tbx2-MO的共注射減少了tbx2-MO胚胎心臟畸形的發(fā)生率及減輕了心臟畸形的程度，，驗證了所設(shè)計合成的tbx2-MO對tbx2基因的抑制作用具有特異性；tbx2-MO組胚胎心臟缺陷包括心室發(fā)育不良、心房擴張、房室管和瓣膜異常以及心率緩慢、心律不齊、心臟停搏、血液返流等，并根據(jù)心臟發(fā)育異常的程度分為輕、中、重度畸形組tbx2-mRNA基因過表達胚胎沒有見到心腔的形成。 結(jié)論斑馬魚是研究心臟發(fā)育的理想模式生物，MO基因阻抑是研究基因功能的良好方法。tbx2在房室特異性分化、房室管、瓣膜和傳導(dǎo)系統(tǒng)形成方面起了重要的作用。 第三部分斑馬魚tbx2基因阻抑胚胎心臟標(biāo)記基因表達分析 目的amhc、vmhc、nppa分別是心房、心室、心房心室肌早期分化的特異性標(biāo)記基因，nkx2.5是心臟原基的分子標(biāo)記，bmp4的表達最初發(fā)生于心臟的原基，最終局限于靜脈竇—心房交界區(qū)、房室交界區(qū)及流出道，versican與房室管和瓣膜的形成密切相關(guān)。對tbx2-MO組胚胎進行以上心臟發(fā)育特異性標(biāo)記基因的表達分析，以進一步闡明tbx2基因在斑馬魚心臟發(fā)育中的作用。 方法進行了以上心臟標(biāo)記基因探針的構(gòu)建，用整胚原位雜交的方法檢測了tbx2-MO胚胎心臟相關(guān)基因的表達情況。 結(jié)果tbx2-MO組胚胎amhc表達范圍增大，vmhc表達范圍縮小，nppa表達強度明顯增強，nkx2.5的表達基本正常，bmp4表達增強，36hpf在心房和心室還有較強的表達，并持續(xù)到48hpf，72hpf bmp4的表達仍然存在，靜脈竇—心房交界區(qū)可見明顯擴張；versican于36hpf后沒有出現(xiàn)正常的退縮，心房心室部位異常表達，并且72hpf仍有持續(xù)表達。 結(jié)論斑馬魚tbx2基因阻抑胚胎心臟標(biāo)記基因的表達分析進一步證實了tbx2基因阻抑胚胎心臟表型的變化，表明了tbx2在房室分化、房室管形成、瓣膜發(fā)育、流出道和靜脈竇—心房交界區(qū)的形成等方面起著重要的作用。
【圖文】：

心內(nèi)膜細胞形成了內(nèi)彎，大概是從圓錐腔的最初位置擴展而來，3OhPf，形成了心房和心室，36hPf，經(jīng)歷了心臟的環(huán)化，形成s環(huán)，環(huán)形的結(jié)果是心室在心房的右面，48hPf，功能性的瓣膜逐漸形成[17，18](圖2):Pt551劉plg.slpl圖2斑馬魚心臟發(fā)育模式圖 (StainierDY，2001)瓣膜的功能是確保心臟血流正確地從心室流向流出道，而不是返流回心房，可見它對于心臟的功能及其重要。

即心內(nèi)膜和心外膜的細胞外基質(zhì)，形成心內(nèi)膜墊 (endoeardialeushions)，后來逐漸重塑成纖維結(jié)構(gòu)和非細胞結(jié)構(gòu)為主的翼狀瓣膜 (remodellingofcushion ereatesvalve)[1刀(圖3):翔山尸圖3斑馬魚心臟瓣膜發(fā)育模式圖 (Staini6rDY，2001)5.斑馬魚基因功能研究常用的方法斑馬魚基因功能研究領(lǐng)域已經(jīng)出現(xiàn)了日新月異的變化，常用的研究方法包括:l)基因突變結(jié)合拯救法(rescue)研究基因功能突變個體已經(jīng)產(chǎn)生了，那么如何去研究突變性狀與相關(guān)的基因的關(guān)系呢?把野生型斑馬魚的同一基因轉(zhuǎn)錄的mRNA注射到突變體的胚胎中，能夠使發(fā)生突變的表型得以恢復(fù)，因此可以確定這一基因與突變表型的關(guān)系。編碼斑馬魚 bonemorPhgenetieProtein一2(BMPZ)的基因發(fā)生突變導(dǎo)致swirl突變，而通過注射 BMpZmRNA就可以使突變體恢復(fù)正常或接近正常的形態(tài)。而即cloPs和squint突變體可以用轉(zhuǎn)化生長因子p(TGF一p)家族的mRNA來恢復(fù)[1”]。當(dāng)然，
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R725.4

【參考文獻】

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本文編號：2710536