【摘要】： 目的 先天性馬蹄內(nèi)翻足(congenital clubfoot，CCF)是常見的嚴重危害兒童健康的先天四肢畸形之一。發(fā)病率為1‰-8‰不等。CCF的病因目前不明確。遺傳流行病學研究認為遺傳因素在CCF的發(fā)病過程中起著重要作用，一般認為屬多基因遺傳。國內(nèi)對CCF的病因研究報道不多，而且大部分從病理學角度去研究，從分子水平研究其發(fā)病機理的較少。Hox基因長久以來被認為是控制脊椎動物胚胎發(fā)育及器官形成的主要基因。眾多的動物實驗研究表明Hox基因參與調(diào)控肢體的骨骼發(fā)育。最近又有報道HoxA基因在肢體肌前體的發(fā)育中起重要作用。我科前期研究發(fā)現(xiàn)HoxD基因與CCF存在相關(guān)關(guān)系。本實驗以HoxA基因作為CCF的候選基因。選擇HoxA所在區(qū)域的微衛(wèi)星位點D7S1808和D7S516對54個核心家系進行TDT檢驗，以確定HoxA基因與CCF的相關(guān)關(guān)系，為揭示CCF的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。 方法 1．收集樣本 收集CCF患者及其父母的外周靜脈血2ml。CCF患者均有典型的臨床表現(xiàn)，經(jīng)X光片及手術(shù)確診，并排除其他原因引起的馬蹄內(nèi)翻足樣畸形。 2．選取微衛(wèi)星位點 從人類基因組數(shù)據(jù)庫(GDB)選取HoxA基因附近的一個四核苷酸重復的微衛(wèi)星DNA標記D7S1808和一個二核苷酸重復的微衛(wèi)星位點D7S516。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。 3．基因型分析及TDT檢驗 飽和氯化鈉法提取基因組DNA。 同位素摻入PCR擴增微衛(wèi)星DNA：PCR反應(yīng)總體積10μl，，其中加入比活度3μCi／pmol、比濃度為10μCi／μl的α~(32)p-dCTP 0.1μl；PCR反應(yīng)條件：D7S1808：94℃ 45sec、56℃ 45sec、72℃ 1min循環(huán)35次。D7S516：94℃ 3Osee、56℃30see、72℃45seC循環(huán)35次。 6%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳:取擴增產(chǎn)物與變性載樣緩沖液的混合物 3討，經(jīng)6%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分離等位基因，電泳條件:1 xTBE， 80W，循環(huán)水溫度30℃，電泳時間3一5小時。 自顯影及洗片:將凝膠轉(zhuǎn)移至濾紙并加蓋保鮮膜，后置于暗盒內(nèi)，一 70℃冰箱自顯影6一18小時，洗片，照相。 基因型分析及TDT檢驗:雙盲法判定等位基因型并記錄。建立TDT表 格，計算XZ值，判定P值，進行TDT檢驗及相關(guān)分析。 結(jié)果 1 .D7s516位點、D7S1808位點等位片段及核心家系等位片段傳遞情況 檢測結(jié)果。D7 5516位點可以檢測出7個等位片段;D7 51 808位點可以檢測 出7個等位片段; 2.TDT檢驗結(jié)果。D7S516位點的等位片段傳遞情況;D751808位點等 位片段傳遞情況;TDT檢驗結(jié)果可見D7 5516處存在傳遞不平衡(X2=20. ‘3s46P0.01);D7Slsos處不存在傳遞不平衡(XZ=11.3196p0.05); 3.我國北方人群中D7 51 808位點各個等位基因的頻率分布情況。 結(jié)論 1.D7ssl6位點可以檢測出7個等位基因，它與CCF存在傳遞不平衡， 提示HoxA基因與先天性馬蹄內(nèi)翻足發(fā)病可能有相關(guān)性。 2.D751808位點可以檢測出7個等位基因，它與CCF不存在傳遞不平 衡。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R726.8

【參考文獻】

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本文編號：2708772