【摘要】： 目的:通過同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)干預(yù)孕鼠,建立大鼠仔鼠先天性心臟畸形模型,探討Hcy與先天性心臟病(congenitalheart defect,CHD)PAX-8基因表達(dá)的關(guān)系及葉酸(Folic Acid,FA)、VitB_(12)對Hcy的干預(yù)作用,從心臟發(fā)育的分子學(xué)角度探討CHD發(fā)生的病因。 方法:40只S-D孕鼠隨機(jī)分為四組:高劑量Hcy建模組(A組)、低劑量Hcy建模組(B組)、高劑量Hcy+(FA+VitB_(12))干預(yù)組(C組)及對照組(D組),每組各10只孕鼠。大鼠自妊娠第7天開始腹腔內(nèi)注射不同劑量的Hcy:A組2%Hcy 2mg/10g/d、B組1%Hcy1mg/10g/d、C組2%Hcy 2mg/10g/d、D組注射生理鹽水0.1ml/10g/d,C組自確定妊娠起,按FA 0.05mg/10g/d+VitB_(12) 1mg/10g%qd給藥,至孕鼠自然分娩時(shí)停藥。每日觀察孕鼠,待其自然分娩當(dāng)日,體視顯微鏡下解剖仔鼠,觀察仔鼠心臟畸形情況。選取A、B、C三組內(nèi)VSD仔鼠心臟各5例,非CHD仔鼠心臟各15例,D組非CHD仔鼠心臟15例,提取RNA,應(yīng)用real time PCR檢測PAX-8 mRNA在仔鼠心臟的表達(dá)情況;同時(shí)選取A、B、C三組VSD仔鼠心臟各2例、非CHD仔鼠心臟各5例、D組非CHD仔鼠心臟5例,5%甲醛固定,石蠟包埋,應(yīng)用免疫組化檢測PAX-8蛋白在仔鼠心臟的表達(dá)情況。 結(jié)果:1、A、B、C、D四組平均產(chǎn)仔數(shù)分別為:9.04只、12.1只、11.56只及13.56只,A、B、C三組平均產(chǎn)仔數(shù)分別與D組比較,p值均＜0.01;A、B、C三組平均產(chǎn)仔數(shù)之間兩兩比較,p值均＜0.01,提示外源性Hcy可導(dǎo)致孕鼠產(chǎn)仔數(shù)減少,通過對孕鼠用FA+Vit B_(12)干預(yù),可增加孕鼠產(chǎn)仔數(shù)。 2、A、B、C、D四組仔鼠心臟畸形率分別為:13.5%、9.17%、8.77%及0.74%,A、B、C三組之間兩兩比較,p值均＞0.05;A、B、C三組分別與D組比較,p值均＜0.01,提示外源性Hcy可引起仔鼠心臟畸形。 3、PAX-8 mRNA在A、B、C、D四組組內(nèi)及組間仔鼠心臟表達(dá)的比較:PAX-8 mRNA在VSD仔鼠心臟細(xì)胞中的表達(dá)均低于非CHD仔鼠,p值均＜0.01。A、B、C三組VSD仔鼠心臟細(xì)胞中的PAX-8mRNA表達(dá)比較:B組＞A組,A組＞C組,p值均＜0.01,B組與C組比較p＞0.05。A、B、C、D四組非CHD仔鼠心臟組織中的PAX-8mRNA表達(dá)比較,p值均＞0.05。VSD仔鼠心肌組織PAX-8 mRNA表達(dá)水平與孕鼠Hcy注射劑量呈負(fù)相關(guān),r=-0.949,p＜0.01。 4、PAX-8蛋白在A、B、C、D四組組內(nèi)及組間VSD仔鼠心臟細(xì)胞中表達(dá)均低于非CHD仔鼠,p值均＜0.01。PAX-8蛋白在A、B、C三組VSD仔鼠之間心臟中的表達(dá)比較無差異,p值均＞0.05。四組非CHD仔鼠心臟細(xì)胞中的表達(dá)比較無差異,p值均＞0.05。 結(jié)論:1、PAX-8mRNA在VSD胎鼠心肌中的呈低表達(dá),且與Hcy劑量呈負(fù)相關(guān),PAX-8基因的低表達(dá)可能與VSD的形成有關(guān)。 2、高水平的Hcy具有胚胎毒性,孕期FA與VitB_(12)干預(yù)可增加平均胎產(chǎn)數(shù),降低Hcy的胚胎毒性。
【圖文】：

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1川，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA逆轉(zhuǎn)錄的結(jié)果，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)檢測分析有無目的基因PAX一8基因及管家基因GAPDH的擴(kuò)增從而判斷cDNA合成的質(zhì)量并判斷口的片段的大小。見圖2一3，與 DNAMarker比照，各片段的PCR反應(yīng)產(chǎn)物的長度與所設(shè)計(jì)的各片段大小預(yù)期值符合，特異性較理想，可進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。電泳條件:電壓10OV;時(shí)間30min。圖2一 3PAX一8基因及GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖。其中PAX一8基因片段大小為 174bp，GApDH片段大小為，140bp.

學(xué)位論文第二章材料與方法設(shè)定每個(gè)循環(huán)的變性期結(jié)束后，程序自動(dòng)記錄上一個(gè)循環(huán)最后10%時(shí)間的平光值，以表示上一個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)的PCR產(chǎn)物的量。反應(yīng)完成后，得到標(biāo)本線，軟件將自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，調(diào)整基線，計(jì)算出Thresholdcycle(Ct值)反應(yīng)均以ddHZO代替模板作為陰性對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上。①PAX一8及GAPDH熒光定量PCR的動(dòng)力學(xué)曲線PCR儀檢測熒光強(qiáng)度的時(shí)相統(tǒng)一設(shè)定于擴(kuò)增反應(yīng)的退火期，本實(shí)驗(yàn)采用作為退火期。40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)將對采集到的每一循環(huán)反的各反應(yīng)管中的的熒光強(qiáng)度增長指數(shù)(D孫)進(jìn)行分析，繪制每一反應(yīng)管的動(dòng)力學(xué)曲線(見圖2一4)。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R725.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2704748