【摘要】： 目的：探討環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental endocrine disruptors，EEDs)與性早熟發(fā)病的關(guān)系，，制定針對(duì)EEDs擬雌激素作用的以中藥為主的治療方案，并深入研究中藥治療的作用機(jī)理。 方法：(1)運(yùn)用反相高效液相色譜法檢測(cè)73例性早熟患兒及年齡、性別匹配的38例正常兒童血清中數(shù)種有代表性的EEDs(包括：洗滌劑降解產(chǎn)物中的4-壬基酚(4-nonylphenol，4-NP)、有機(jī)氯農(nóng)藥DDT的代謝產(chǎn)物中的二氯二苯二氯乙烯(1，1-dichloro-2，2，bis(p-chlorophenyl)ethylene，p，p’-DDE)、塑料添加劑中的鄰苯二甲酸-2-乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)的含量；同時(shí)測(cè)定性早熟患兒的靶器官發(fā)育指標(biāo)，包括子宮、卵巢體積，骨密度及血清雌二醇E_2水平。對(duì)兩組兒童的EEDs血清含量進(jìn)行分析，并將血清EEDs含量與靶器官發(fā)育指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析及多元線性回歸分析。(2)以21d雌性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選取4-NP、雙酚A(bisphenol A，BPA)、DEHP為染毒物質(zhì)，均設(shè)高中低劑量，并將4-NP和BPA以低劑量混合喂飼連續(xù)三天，于末次給藥后24h處死。以子宮濕重、臟器系數(shù)、子宮內(nèi)膜及平滑肌增生程度和細(xì)胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的蛋白表達(dá)作為檢測(cè)指標(biāo)，采用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。(3)制定針對(duì)EEDs擬雌激素作用的中藥治療方案，治療受EEDs暴露的性早熟患兒及染毒動(dòng)物，以上述生殖器官及骨骼發(fā)育水平作為檢測(cè)指標(biāo)；并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time FQ-PCR)及免疫組織化學(xué)方法(immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)靶器官雌激素受體α(estrogen receptor alpha，ERα)、雌激素受體β(estrogen receptor beta，ERβ)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(insulin-like factor-1 receptor，IGF-1R)的基因和蛋白的表達(dá)情況，采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：(1)每一例正常兒童血清中均檢測(cè)到一定含量的p，p’-DDE(14.93～40.39ng/ml)，部分正常兒童血清中檢測(cè)到一定含量的4-NP及DEHP(ND～6.77ng/ml，ND～17.61ng/ml)。性早熟患兒血清中4-NP含量(ND～16.68ng/ml)、p，p’-DDE含量(40.03～91.68ng/ml)及DEHP含量(ND～64.71ng/ml)顯著高于正常兒童(P＜0.01)。性早熟患兒血清中4-NP與子宮體積、卵巢體積、骨密度均呈顯著正相關(guān)(r=0.394，0.286，0.237；P＜0.01)；p，p’-DDE與子宮體積呈顯著正相關(guān)(r=0.306；P＜0.01)。4-NP對(duì)子宮體積的作用強(qiáng)度明顯高于p，p’-DDE。(2)染毒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高中劑量的4-NP(200mg/kg，100mg/kg)和BPA(600mg/kg，400mg/kg)能夠使染毒動(dòng)物的子宮濕重及臟器系數(shù)明顯增加(P＜0.01)，并且具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系；4-NP和BPA高中低三種劑量都能夠使子宮內(nèi)膜上皮增高，平滑肌增厚，PCNA蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)。低劑量的4-NP(50mg/kg)和BPA(200mg/kg)混合喂飼后上述指標(biāo)均較單獨(dú)喂飼組顯著增加(P＜0.01)。(3)第一部分篩查出的EEDs暴露水平增高的性早熟患兒經(jīng)中藥治療三個(gè)月后，子宮體積、血清E_2含量、骨礦含量、骨密度、血清骨鈣素含量較治療前明顯減小或降低(P＜0.01)。4-NP和BPA染毒的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)中藥治療后，所有治療組的子宮濕重、臟器系數(shù)、骨密度、子宮內(nèi)膜上皮高度、子宮平滑肌厚度及PCNA蛋白表達(dá)均比實(shí)驗(yàn)組明顯降低(P＜0.05)。中藥治療方案能夠顯著下調(diào)ERα及ERβmRNA在子宮、乳腺和骨骺端的表達(dá)水平(P＜0.05)，降低ERα及ERβ在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和骨骺端生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)；能夠顯著下調(diào)EGFR mRNA在子宮、乳腺的表達(dá)水平(P＜0.05)，降低EGFR在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)；能夠顯著下調(diào)IGF-1R mRNA在干骺端的表達(dá)水平(P＜0.05)，降低IGF-1R在骨骺端生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)。 結(jié)論：(1)當(dāng)前正常兒童已經(jīng)較普遍地暴露于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，只不過(guò)暴露程度比性早熟患兒略輕而已；EEDs暴露與兒童性早熟的發(fā)病有密切關(guān)系，是其重要的致病因素之一；不同種類(lèi)的EEDs對(duì)靶器官的致病作用強(qiáng)度有所不同。(2)動(dòng)物染毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了EEDs的擬雌激素作用及其劑量-效應(yīng)關(guān)系；進(jìn)一步驗(yàn)證了臨床研究結(jié)果及其推論，證實(shí)EEDs的暴露程度與性早熟發(fā)病有密切關(guān)系；不同種類(lèi)EEDs之間可以發(fā)揮聯(lián)合增效作用，暴露人群更易受到不良影響；為子宮營(yíng)養(yǎng)試驗(yàn)提供了更為敏感的檢測(cè)指標(biāo)。(3)制定了針對(duì)EEDs擬雌激素作用的中藥治療方案；研究結(jié)果表明所用中藥能夠有效拮抗EEDs的雌激素樣活性，明顯減輕EEDs對(duì)機(jī)體性發(fā)育及骨骼發(fā)育造成的不良影響；能夠顯著下調(diào)靶細(xì)胞雌激素受體的表達(dá)水平，降低機(jī)體對(duì)EEDs作用的敏感性；能夠顯著下調(diào)靶細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)水平，干擾交叉對(duì)話機(jī)制，進(jìn)一步加強(qiáng)其對(duì)EEDs擬雌激素活性的拮抗作用。
【圖文】：

圖卜l4一NP、p，p‘一oDE、OEHp高效液相色譜圖1.5.3定量分析:樣品處理后進(jìn)行色譜分析，所得的峰面積與樣品的工作曲線相比較，通過(guò)計(jì)算分別得出樣品中4一NP、p一P’DDE、DEHP的實(shí)際濃度。1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線1.6.1標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限:配制2、10、50、100、500、1000ng/ml6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，做濃度一峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。4一NP標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=26.62+854.39x，r=0.9988;p，p，一DDE標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y二一1.18+693.83X，r=0.9999;DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=一0.02+230.00X，r=0.9999。在本實(shí)驗(yàn)條件下，ODS一3柱對(duì)4一NP、p一P’DDE、DEHP的檢測(cè)下限均為ing/ml，信噪比為2。1.6.2工作曲線:以血清為空白，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得的峰面積減去空白值(該份血清的測(cè)定值)，繪制濃度一峰面積工作曲線。4一NP工作曲線為Y二30.49十655.12X，

(ng/ml)圖1一3性早熟組和正常對(duì)照組4一P、P，p，一DDE、DEHP血清含量分布情況由表1一3及圖1一3可以看出，性早熟患兒血清中4一NP、P，pr一DDE和DEHP的含量均顯著高于正常對(duì)照組(尸<0.01)。性早熟組患兒4一NP、P，p’一DDE和DEHP的血清含量大多在4ng/ml、song/ml、20ng/ml以上。3討論環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)是指環(huán)境中存在的能夠干擾機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)諸環(huán)節(jié)并導(dǎo)致異常效應(yīng)的物質(zhì)。近年來(lái)國(guó)外有大量文獻(xiàn)報(bào)告，由洗滌劑、農(nóng)藥及塑料等制造業(yè)向自然界中排放的物質(zhì)及其分解產(chǎn)物含有一系列的EEDS〔’·4、37〕。早在1995年，美國(guó)環(huán)境與自然資源委員會(huì)就把EEDs的研究列為其五個(gè)最優(yōu)先研究項(xiàng)目之一。EEDs所引起的一系列危害也逐漸引起中國(guó)政府重視。這些物質(zhì)具有一些共同的生物學(xué)特點(diǎn)，例如在環(huán)境中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易被生物降解;大多脂溶性強(qiáng)易被機(jī)體吸收，并可通過(guò)食物鏈在生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行生物富集而蓄積。EEDS可經(jīng)某些途徑包括污染的水源、食物或經(jīng)皮膚
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R725.8;R272

【引證文獻(xiàn)】

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6 賴蓉蓉;陳華;;小兒性早熟的中醫(yī)藥治療研究進(jìn)展[J];內(nèi)蒙古中醫(yī)藥;2011年14期

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5 朱琳;爪哇猴由環(huán)境內(nèi)分泌干擾物引致性早熟疾病模型的建立及中藥作用機(jī)制的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2699031