【摘要】： 前言 腸黏膜屏障是機體最重要的免疫防御屏障,將機體與腸道內(nèi)的外源性物質(zhì)隔離開來,避免病原微生物的侵襲和抗原分子的損傷。腸黏膜屏障主要包括以下三個方面:①腸道連續(xù)的黏膜上皮構(gòu)成的機械屏障,②由腸道淋巴樣組織細胞網(wǎng)提供的細胞及體液免疫系統(tǒng),也稱免疫屏障,③正常的大量的腸道厭氧菌群,防止致病微生物的過度增生及在腸道黏膜的定植,構(gòu)成微生物屏障。 腸黏膜的機械屏障由腸表面黏液,微絨毛,腸黏膜上皮細胞及其間的連接以及黏膜的特殊結(jié)構(gòu)組成,是腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。上皮細胞的形態(tài)改變、連接縫隙增寬或開放數(shù)目增多都會影響上皮細胞屏障功能,使通透性增加。目前研究發(fā)現(xiàn)腸黏膜通透性增加參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展,如:炎癥性腸病、敗血癥、燒傷、終末期肝病、重癥胰腺炎等,進一步引起全身炎癥反應(yīng)綜合征甚至多器官功能衰竭。近期研究發(fā)現(xiàn)腸黏膜屏障的破壞在兒科急慢性疾病的發(fā)生發(fā)展中亦具有顯著的意義:急性期,細菌移位可引起敗血癥及多器官功能衰竭;而嬰兒時期的腸黏膜屏障破壞將會成為隨后產(chǎn)生的部分變應(yīng)性疾病的始發(fā)因素,如:濕疹,食物過敏,谷膠病,1型糖尿病,哮喘,炎癥性腸病及孤獨癥等。因此腸黏膜屏障功能及其完整性這一課題在兒科領(lǐng)域也受到越來越多的關(guān)注。 腸上皮屏障通透性增加與多種因素有關(guān),不僅包括疾病的起始致病因子如感染、缺血等,也包括機體繼發(fā)產(chǎn)生的內(nèi)源性免疫介質(zhì)。尋找這個炎癥連鎖反應(yīng)中的關(guān)鍵因素一直是我們努力的方向。有趣的是,一直在循環(huán)系統(tǒng)中倍受關(guān)注的血小板活化因子(PAF)同樣可以由腸上皮細胞產(chǎn)生,存在于正常的小腸組織中,并調(diào)節(jié)黏膜的通透性。更為重要的是實驗發(fā)現(xiàn),給予小劑量PAF,在不足以引起腸損傷的情況下,即可以增加腸黏膜的通透性,觸發(fā)細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的活化。因此,PAF被認為是腸上皮屏障通透性增加的關(guān)鍵因素,但具體作用機制和方式還不明了。 本實驗中我們應(yīng)用Caco-2細胞株建立體外腸上皮細胞屏障模型,觀察PAF對腸上皮細胞屏障通透性的影響,確定其作用位點,并在此基礎(chǔ)上進一步探討PAF對維持腸黏膜機械屏障正常通透性的細胞骨架蛋白F-actin,構(gòu)成細胞緊密連接的重要蛋白Occludin,Claudin-1,ZO-1,以及在腸道的自我保護和修復中具有重要意義的三葉肽ITF在基因、蛋白、定位等方面的影響,系統(tǒng)探討PAF對腸黏膜機械屏障的損傷機制。 腸三葉因子(ITF)屬三葉肽家族,是近年來被人們注意到的對胃腸道粘膜屏障有重要保護和修復作用的多肽,是一種新型的生長因子類多肽物質(zhì)。它的生理功能主要體現(xiàn)在兩個方面:首先ITF可與粘液糖蛋白相互作用或交聯(lián),形成粘彈性的粘液凝膠層,對腸道粘液層起固定和支持作用,防止有害物質(zhì)對腸粘膜細胞的損傷,從而增強胃腸道粘膜屏障的保護能力;其次ITF具有很強的促進細胞增殖與移行的能力,被認為是粘膜損傷的快速反應(yīng)肽,在損傷早期即可表達,促進受損區(qū)域上皮細胞重建并加快上皮細胞移行速度,因而在腸道的自我保護機制中占據(jù)重要地位。大量的動物實驗也證明腸三葉因子在維持腸上皮細胞的完整性,恢復腸黏膜的正常通透性方面均起到重要作用。近期的體外實驗也發(fā)現(xiàn)ITF可以調(diào)控緊密連接蛋白Claudin-1和Claudin-2的表達而影響腸上皮的跨上皮阻力。但PAF是否可以影響內(nèi)源性ITF的表達?外源性給予基因重組ITF是否可以起到保護作用?其機制如何?這些問題的回答也為臨床應(yīng)用ITF治療胃腸黏膜損傷性疾病提供了可靠的理論依據(jù)。 材料和方法 一、細胞培養(yǎng) Caco-2細胞株,來源于人大腸癌細胞,可分化成有極性的腸上皮細胞。應(yīng)用含有150 ml/L胎牛血清和青霉素-鏈霉素雙抗液的RPMI 1640高糖培養(yǎng)液,在37℃、50 ml/L CO_2條件下進行培養(yǎng),每7 d按1:2的比例傳代。將細胞接種于transwell、蓋玻片、六孔板上或培養(yǎng)瓶中,待細胞生長融合至80%左右,換無血清培養(yǎng)液,按實驗分組加藥,進行后續(xù)實驗。每種實驗均選取至少三組非同代細胞進行。 二、實驗分組 分別設(shè)正常對照組、實驗組(含模型對照組)、ITF預(yù)防組、ITF治療組。 正常對照組:不加刺激物及干預(yù)因素。 實驗組:加入PAF,終濃度分別為50ng%qL、100ng/L和200ng%qL,并把終濃度100ng%qL的組作為模型對照組,分別作用2,4,8,12,24,48h。 ITF預(yù)防組:先加入ITF0.3g%qL,30min后加入PAF100ng%qL,共培養(yǎng)24h。 ITF治療組:先加入PAF100ng/L,30min后加入ITF0.3g%qL,共培養(yǎng)24h。 三、實驗方法及檢測指標 1、體外腸上皮細胞屏障模型的建立 應(yīng)用Caco-2細胞株在transwell上建立體外腸上皮細胞屏障模型,并應(yīng)用跨上皮細胞電阻(TEER)和熒光黃透過率兩種指標檢測腸上皮細胞屏障的形成情況。 2、PAF對細胞增殖和凋亡的影響 (1)MTT比色法檢測細胞活力,反映細胞增殖情況。 (2)用Annexin V-EGFP和Hoechst試劑盒,應(yīng)用流式細胞技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù),通過細胞膜和細胞核染色聯(lián)合檢測細胞凋亡的發(fā)生。 3、PAF對腸上皮細胞屏障通透性的影響和ITF的保護作用 (1)TEER的測定:應(yīng)用EVOM測定Caco-2單層上皮細胞的TEER。 (2)熒光黃透過量的檢測:應(yīng)用熒光黃作為標記物,檢測PAF或ITF對Caco-2細胞細胞旁轉(zhuǎn)運的影響。用熒光分光光度計測定熒光黃吸光度(激發(fā)波長427nm,發(fā)射波長536 nm),根據(jù)標準曲線計算熒光黃濃度。 4、PAF和ITF對腸上皮細胞間緊密連接的影響 透射電鏡下觀察加入PAF或/和ITF不同時間后,Caco-2細胞間緊密連接形態(tài)學的改變。 5、PAF和ITF對腸上皮細胞骨架蛋白F-actin的影響 應(yīng)用羅丹明-鬼筆環(huán)肽(TRITC-phalloidin)特異性熒光探針直接標記F-actin,流式細胞技術(shù)測定F-actin的含量;直接免疫熒光技術(shù)觀察F-actin的定位和重排情況。 6、PAF對內(nèi)源性ITF表達的影響 給予不同濃度PAF作用不同時間后,應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測PAF對ITFmRNA和蛋白定位的影響。 7、PAF和ITF對腸上皮細胞緊密連接蛋白Occludin,Claudin-1,ZO-1表達和定位的影響 應(yīng)用免疫熒光、蛋白印跡雜交(Western blot)和實時定量PCR技術(shù)檢測腸上皮細胞緊密連接蛋白Occludin,Claudin-1,ZO-1定位和蛋白、基因表達的變化情況。 四、統(tǒng)計學分析 所有實驗均重復3次以上,結(jié)果用Mean±SD表示,統(tǒng)計由SPSS13.0軟件完成。采用One-Way ANOVA法比較總體和組間差異,P＜0.05認為有顯著差異。 結(jié)果 1、利用Caco-2細胞建立腸上皮細胞屏障 Caco-2細胞隨著培養(yǎng)時間的延長,逐漸融合成片,成單層生長,光鏡下呈多角形、不規(guī)則多邊形或鵝卵石樣,相鄰細胞連接緊密,可見致密的反光帶;TEER值逐漸升高,至21天左右,細胞形成緊密單層,TEER值達到300～400Ω/cm~2,對熒光黃透過量很小。電鏡下發(fā)現(xiàn)細胞呈高分化,細胞間形成完整的緊密連接,絨毛整齊,極性形成,成單層排列。體外腸上皮細胞屏障建立。 2、PAF對細胞增殖和凋亡的影響 MTT染色發(fā)現(xiàn),即使大劑量的PAF也未影響到細胞的增殖和細胞活力,各加藥濃度與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。 應(yīng)用Annexin V和Hoechst染色試劑盒,應(yīng)用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測,均未發(fā)現(xiàn)給予PAF后出現(xiàn)明顯的細胞凋亡增加(P＞0.05)。 3、PAF對腸上皮細胞屏障通透性的影響和ITF的保護作用 與對照組相比,50ng%qLPAF即可引起TEER的下降和熒光黃透過量的增加,以PAF100ng/L組作用最明顯(P＜0.01);在作用時間上,PAF100ng/L作用4h后,TEER值開始下降(P＜0.01),熒光黃透過量開始升高(P＜0.01),24h這種作用達到最強(P＜0.01)。預(yù)防和治療性給予ITF后,與模型對照組相比,TEER有所恢復,熒光黃透過量減少,預(yù)防組作用更明顯(P＜0.05)。 4、PAF和ITF對腸上皮細胞間緊密連接的影響 正常Caco-2細胞,緊密連接結(jié)構(gòu)完整,呈致密的帶狀結(jié)構(gòu)。加入PAF100ng/L作用24h后,電鏡下可見緊密連接結(jié)構(gòu)破壞、斷裂,細胞間隙增寬。加入ITF0.3 g/L共同作用24h,緊密連接及細胞極性均部分恢復。 5、PAF和ITF對腸上皮細胞骨架蛋白F-actin的影響 在正常Caco-2細胞,F-actin主要環(huán)繞于細胞周邊,細胞中央偶爾可見不規(guī)則纖維絲。細胞間F-actin排列緊密圓滑,輪廓完整連續(xù),無明顯間隙,細胞界限清晰。 PAF作用8-12h后,就可見細胞骨架F-actin出現(xiàn)重排,外周致密帶邊緣變的毛糙不規(guī)整,細胞中央有彌散actin及少量應(yīng)力纖維形成。作用24h,出現(xiàn)明顯橫跨細胞的應(yīng)力纖維結(jié)構(gòu),48h后周邊肌動蛋白絲帶變細,斷斷續(xù)續(xù),胞漿內(nèi)仍可見少量應(yīng)力纖維。給予不同濃度的PAF發(fā)現(xiàn),以PAF100ng%qL破壞最為明顯。 當預(yù)防或治療性給予ITF并共同培養(yǎng)24h后,正常F-actin染色的細胞比例增加,周邊肌動蛋白絲帶逐漸清晰,胞漿內(nèi)應(yīng)力纖維減少,但外周致密帶邊緣仍毛糙不規(guī)整,環(huán)點狀斷裂未完全修復。比較而言,預(yù)防性給藥恢復細胞骨架正常結(jié)構(gòu)的能力更強。 流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn):PAF作用8h后,F-actin含量開始減少,峰左移;24h后明顯下降,峰左移明顯,48h與24h相比無明顯差異。PAF100ng%qL組下降最為明顯,與對照組相比差異顯著(P＜0.01)。給予ITF作用24h,F-actin的含量有所增加,與模型組相比差異顯著(P＜0.01),但仍低于對照組;峰右移,但未移回原位。 6、PAF對內(nèi)源性ITF表達的影響 給予50ng%qL PAF 8h后,ITFmRNA表達開始下降,24h降到最低,48h有所恢復,但與對照組比較沒有統(tǒng)計學差異。PAF100ng%qL組作用4h ITFmRNA即開始下降,24h降到低谷(P＜0.05),48h有所恢復。進一步加大PAF濃度(200ng%qL),與100ng/L組無明顯差異。 免疫組化顯示在正常Caco-2細胞中,ITF陽性表達呈棕黃色顆粒,位于胞漿內(nèi),胞膜也有少量表達。給予不同濃度PAF(50,100,200ng%qL)作用24h,ITF表達減少,染色變淡,以100ng/L組改變最明顯。 7、PAF和ITF對腸上皮細胞緊密連接蛋白Occludin,Claudin-1,ZO-1表達和定位的影響 (1)緊密連接蛋白Occludin,Claudin-1,ZO-1在腸上皮細胞的定位改變 正常Caco-2細胞Occludin,Claudin-1,ZO-1主要分布在細胞內(nèi)近胞膜處,細胞間連接緊密。PAF50ng%qL作用24h后,Occludin邊緣粗糙呈鋸齒狀,熒光信號減弱,向膜下轉(zhuǎn)移。隨PAF濃度加大(100ng%qL)改變更加明顯,細胞間出現(xiàn)間隙,Occludin環(huán)斷裂,崩解,胞漿內(nèi)見陽性染色。但PAF濃度繼續(xù)加大(200ng/L),改變并未繼續(xù)加重。Claudin-1,ZO-1表達位置和變化規(guī)律與Occludin基本一致。預(yù)防和治療性給予ITF后,可明顯減輕Occludin,Claudin-1,ZO-1的破壞,邊緣變得連續(xù),但沒有完全恢復。ITF預(yù)防組效果更明顯。 (2)Occludin,Claudin-1,ZO-1 mRNA表達的改變 利用標準曲線對樣品中的Occludin,Claudin-1,ZO-1基因和GAPDH基因進行定量,發(fā)現(xiàn)不同濃度PAF組與正常對照組比較Occludin,Claudin-1,ZO-1 mRNA的水平均有降低,以PAF 100ng/L組改變最明顯(P＜0.01),三者變化趨勢一致;基因水平從4h開始降低,到24h降到低谷,48h有所恢復。以PAF 100ng/L組作為模型組,預(yù)防或治療性給予ITF0.3g%qL作用24h,預(yù)防和對照組Occludin,Claudin-1,ZO-1基因表達均較模型組增強,但未恢復到對照組水平,預(yù)防組作用更明顯(P＜0.05),但兩組之間無統(tǒng)計學差異。 (3)Occludin,Claudin-1,ZO-1蛋白表達的改變 Occludin和Claudin-1發(fā)揮功能需要絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化,磷酸化會使分子量上調(diào)。 應(yīng)用Western blot法對Occludin進行蛋白雜交,發(fā)現(xiàn)兩條蛋白條帶,分別在65kDa和80kDa,灰度分析發(fā)現(xiàn)各組標本65kDa的蛋白含量無統(tǒng)計學差異,但是對于80kDa的蛋白含量,PAF組較對照組明顯下降并呈劑量依賴性(P＜0.01); 對Claudin-1進行蛋白雜交,發(fā)現(xiàn)25kDa和20kDa兩條蛋白條帶,20kDa的蛋白含量無統(tǒng)計學差異(P＞0.05),但是25kDa的蛋白含量,PAF組較對照組明顯下降并呈劑量依賴性(P＜0.01); 對ZO-1進行蛋白雜交,發(fā)現(xiàn)在220kDa處出現(xiàn)特異性蛋白條帶,其灰度隨PAF給藥濃度的增加而降低,以PAF 100ng%qL作用24h降到最低,與對照組相比P＜0.01。 預(yù)防或治療性給予ITF后,三者的蛋白表達較模型組增強,但未恢復到對照組水平,與mRNA表達的變化趨勢具有一致性。 結(jié)論 1、培養(yǎng)2-3w的Caco-2細胞可作為體外研究腸上皮細胞屏障的工具。 2、PAF可直接破壞腸上皮細胞屏障,其增加腸上皮細胞通透性的作用是凋亡非依賴性的,其作用位點在旁細胞途徑。 3、ITF可以通過恢復緊密連接的結(jié)構(gòu)降低腸通透性,從而發(fā)揮其保護作用。 4、PAF引起細胞骨架F-actin的重排和再分布以及蛋白含量的減少,是PAF引起腸上皮細胞屏障通透性增加的機制之一。 5、PAF使內(nèi)源性ITF基因和蛋白表達減少,抑制了腸道的自我保護和修復能力。 6、外源性重組ITF部分逆轉(zhuǎn)細胞骨架F-actin的重排和再分布,可以作為一個腸道保護因素。 7、PAF可以引起緊密連接蛋白Occludin,Claudin-1和ZO-1的基因和蛋白水平的改變以及異常分布,具有劑量和時間依賴性,且三者的改變具有協(xié)同性,這可能是PAF引起腸上皮細胞屏障破壞的內(nèi)在機制。 8、ITF可以部分恢復緊密連接蛋白Occludin,Claudin-1和ZO-1的基因和蛋白水平改變以及異常分布,恢復緊密連接的正常結(jié)構(gòu),可能是其保護腸黏膜屏障的一個重要機制。
【圖文】：

8400.7707士.017320夕999200.7573士.012170.81210100.8063士.002730.7103、PAF對細胞凋亡的影響在正常細胞中，PS(磷脂酞絲氨酸)只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而細胞凋亡早期，細胞膜中的PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。AnnexinV是一種分子量35一36KD的C擴+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與PS有高度親和力，與凋亡早期細胞的膜結(jié)合，因此，AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。另外，細胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)會固縮。用Hoechst染色時，細胞核會呈致濃染，或呈碎塊狀致密濃染。是一種快速簡便的檢測細胞凋亡的方法。本實驗應(yīng)用AlinexinV和Hoechst染色試劑盒，應(yīng)用熒光顯微鏡和流式細胞儀測，均未發(fā)現(xiàn)給予PAF后出現(xiàn)明顯的細胞凋亡增加(圖1.1，圖片1.3下，1.3上)

TEER值即有所下降，但與加入隊F前比較沒有統(tǒng)計學意義;4h開始TE值明顯下降，，24h達到最低，與加入PAF前比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.0提示PAF降低Caco一2細胞的TEER還具有時間依賴性。預(yù)防和治療性給予IT后，TEER有所恢復，預(yù)防組作用更明顯(P<0.05)(表1.2，圖1.2)。表1.2，不同濃度隊F和rrF致Caco一2單層上皮細胞TEER的下降ControlPAF(50ng/L)PAF(100n留L)PAF(200n歲L)ITFPreITFtreZh4575士19.7480.75士12.36123.5肚2409△110.75土24.08么52.00士24.78*81.5肚15.584h52.75士9.7180.0肚18.57*137.25士23.17△△11700士21.11△4275士24.16*85.5肚9.31sh69.75士18.0798.75士7.85*158.25士2631必12725土25.56△53.25士22.87*9575士12.47*12h61.00士14.0878.5肚19名l*136.25士29.74△125.25士2735△54.50士26名4*92.75士11.5224h52.75士157491.50士11.78*146.75士26.69砧143.75士2509必53.75士18.28**99.0肚13.1648h45.25士18.8998.25士1.84133.0肚24.36砧118.75士2542必52.25士13.85**98.0肚12.23△與control相比p<0.05△△p<0.01*與PAF(100。g/L)相t匕p<0.05**p<0.01
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R725.7

【參考文獻】

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本文編號：2698948