【摘要】：前言 早產(chǎn)兒慢性肺疾病(CLD)是早產(chǎn)兒長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧、機(jī)械通氣治療或感染后的最常見并發(fā)癥。盡管其發(fā)生機(jī)制尚不清楚,但早期的肺泡上皮損傷及晚期不可逆的肺間質(zhì)纖維化的病理結(jié)局已被公認(rèn)。近年來(lái),隨著極低出生體重兒的存活率明顯提高,CLD的發(fā)生率也在逐年增加,現(xiàn)已成為威脅早產(chǎn)兒健康和生命的首要疾病。雖然CLD的病因復(fù)雜,但長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧氣目前被學(xué)者們認(rèn)為是早產(chǎn)兒CLD發(fā)生的最主要原因及最危險(xiǎn)因素。因此,探索高氧致早產(chǎn)兒CLD肺纖維化的發(fā)生機(jī)制是國(guó)內(nèi)外研究的焦點(diǎn)問(wèn)題。 早產(chǎn)兒CLD的主要病理變化是肺成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積及肺組織的纖維化。目前有關(guān)其發(fā)病機(jī)理的研究多集中在如下幾個(gè)方面:(1)因早產(chǎn)兒肺組織的抗氧化能力尚不成熟(如超氧化物岐化酶等缺乏),當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧后,大量的氧自由基生成,導(dǎo)致氧化應(yīng)激性肺損傷。(2)細(xì)胞因子作用的結(jié)果。越來(lái)越多的證據(jù)表明,CLD的發(fā)生與多種細(xì)胞因子的協(xié)調(diào)作用密切相關(guān)。其中涉及促炎和促纖維化的細(xì)胞因子包括:IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等,這些物質(zhì)引起炎癥反應(yīng)過(guò)程,募集并刺激炎癥細(xì)胞。另外,IL-4、IL-10、TGF-β_1、VEGF等細(xì)胞因子發(fā)揮抗炎、促纖維化及調(diào)節(jié)新生血管形成的作用。(3)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)動(dòng)態(tài)平衡的破壞也參與了CLD的發(fā)生�；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一個(gè)蛋白水解酶家族,主要作用降解細(xì)胞外基質(zhì),在肺發(fā)育過(guò)程中起重要作用。膠原酶MMP-1和MMP-8降解Ⅰ型膠原(細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白),明膠酶MMP-2、MMP-9降解Ⅳ型膠原(肺基底膜的主要成分)。金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)調(diào)節(jié)了MMPs的活性。若上述MMPs表達(dá)水平減少或TIMPs表達(dá)增加都可使ECM沉積而發(fā)生纖維化。 p16基因又稱多腫瘤抑制基因,最早是作為一重要的抑癌基因被發(fā)現(xiàn)的,直接作用于細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞的增殖,目前被認(rèn)為是重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子。近年來(lái)已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究。在腫瘤的研究中已發(fā)現(xiàn),p16基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化異常對(duì)其基因表達(dá)有明顯的抑制作用,可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá),從而引起相應(yīng)表達(dá)基因的沉默。大量的研究資料結(jié)果表明,因p16基因的啟動(dòng)子甲基化而引發(fā)的p16失活與多種惡性腫瘤、腸上皮化生、銀屑病、燒傷后瘢痕的形成及衰老的發(fā)生等等密切相關(guān)。那么在早產(chǎn)兒CLD的發(fā)生中,因肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞異常增殖而導(dǎo)致的肺纖維化是否與上述疾病有類似的基因調(diào)控過(guò)程,尚有待于研究和闡明。 故本研究將在我們以往研究的基礎(chǔ)上,以高氧誘導(dǎo)的早產(chǎn)鼠CLD模型和分離培養(yǎng)的肺間質(zhì)的成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象,從組織學(xué)、細(xì)胞和分子的水平,研究p16基因在CLD肺纖維化中作用機(jī)制,從新的角度探索早產(chǎn)兒肺纖維化的發(fā)生機(jī)制,從而為重新設(shè)計(jì)CLD的有效防治途徑尋找新的突破口。 實(shí)驗(yàn)材料及方法 一、動(dòng)物模型制備 本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。實(shí)驗(yàn)組將剖宮取出的早產(chǎn)Wistar大鼠(連同母鼠)生后立即置于氧箱中,持續(xù)輸入氧氣,維持FiO_2為0.90(用測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)),CO_2濃度＜0.5%(用鈉石灰吸收CO_2),溫度25℃～27℃,濕度50%～70%,每24 h定時(shí)開箱30 min,添加水、飼料及更換墊料,并與對(duì)照組交換母鼠以避免其因氧中毒致喂養(yǎng)能力下降。對(duì)照組FiO_2為0.21,具體方法及實(shí)驗(yàn)控制因素同實(shí)驗(yàn)組。 二、標(biāo)本采集和處理 每組分別于實(shí)驗(yàn)后3,7,14和21d隨機(jī)選取10只Wistar早產(chǎn)鼠麻醉(5%水合氯醛0.6ml/100mg)后處死,將左肺組織置于4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋,常規(guī)制備5μm組織切片。右肺組織置于無(wú)Rnase的Eppendorf管中,-80℃凍存,用于其他指標(biāo)檢測(cè)。 三、肺成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 分別于實(shí)驗(yàn)后3,7,14和21d隨機(jī)選取Wistar早產(chǎn)鼠6只,經(jīng)5%水合氯醛(0.6ml/100mg)腹腔麻醉后處死,無(wú)菌條件下迅速取肺,采用胰酶消化、離心、反復(fù)貼壁法,分離純化早產(chǎn)鼠肺成纖維細(xì)胞,并進(jìn)行原代培養(yǎng),經(jīng)波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法鑒定,按1:2或3接種傳代,取第三代肺成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 四、實(shí)驗(yàn)方法和觀察指標(biāo) (一)肺形態(tài)學(xué)觀察:切片進(jìn)行常規(guī)HE染色,光鏡下動(dòng)態(tài)觀察肺組織的病理改變及進(jìn)行肺組織纖維化程度的判定。 (二)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)肺組織Ⅰ型膠原的含量。 (三)免疫組化法及Western-blot技術(shù)觀察和檢測(cè)肺組織p16蛋白的表達(dá)狀態(tài)及水平。 (四)MSP和半巢式PCR檢測(cè)肺組織p16基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。 (五)半巢式PCR檢測(cè)肺成纖維細(xì)胞的p16基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。 (六)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織和肺成纖維細(xì)胞p16 mRNA表達(dá)水平。 (七)免疫組化法觀察肺成纖維細(xì)胞p16、PCNA的蛋白表達(dá)。 (八)MTT法觀察肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)活力。 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)數(shù)資料采用x~2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spearman,采用Logistic回歸法求OR值(比值比),分析關(guān)聯(lián)度。顯著性檢驗(yàn)水平為0.05。 結(jié)果 一、肺形態(tài)學(xué)觀察 1、肺組織病理改變:對(duì)照組3d時(shí)終末氣腔大小欠規(guī)則,數(shù)量較多,肺泡間隔稍厚;實(shí)驗(yàn)組3d時(shí)可見小血管擴(kuò)張、充血,肺泡或間隔內(nèi)有少量出血,滲出以中性粒細(xì)胞為主,肺水腫,間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞增多。對(duì)照組7d時(shí)肺泡形態(tài)較規(guī)則,大小均勻;而實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)肺泡內(nèi)出血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)細(xì)胞增多,同時(shí)可見終末氣腔擴(kuò)張、小肺泡數(shù)量減少及肺泡分隔減少等;對(duì)照組14d和21d進(jìn)行性肺泡化,肺泡分隔逐步增加,小肺泡數(shù)量增多等;同期實(shí)驗(yàn)組肺泡間隔更寬,有小灶或多灶狀實(shí)變,肺組織正常結(jié)構(gòu)破壞,終末氣腔擴(kuò)張更顯著、小肺泡數(shù)量減少。 2、肺組織纖維化評(píng)分 兩組3,7d肺纖維化程度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),實(shí)驗(yàn)組14,21d肺纖維化評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。 二、肺組織Ⅰ型膠原的水平于實(shí)驗(yàn)后3,7d,兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),14d實(shí)驗(yàn)組升高(P＜0.05),21d明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。 三、肺組織p16蛋白的表達(dá)狀態(tài)及水平 肺組織p16蛋白表達(dá)主要在肺間質(zhì)的成纖維細(xì)胞,其次在氣道黏膜上皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞可見少量表達(dá),主要定位于細(xì)胞核,少量于胞漿。兩組3d無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,7d低于對(duì)照組(P＜0.05),14,21d明顯低于對(duì)照組(蛋白的半定量:P＜0.05:Western-blot:P＜0.01)。免疫組化法p16蛋白的半定量分析與Western-blot檢測(cè)p16蛋白水平趨勢(shì)一致。 四、肺組織p16基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài) 應(yīng)用半巢式PCR檢測(cè)p16甲基化狀態(tài),暴露高氧后,7d發(fā)生率則為50%(5/10),14d為60%(6/10),21d高達(dá)80%(8/10)。應(yīng)用MSP檢測(cè)p16甲基化狀態(tài),暴露高氧后,7d發(fā)生率則為40%(4/10),14d為50%(5/10),21d高達(dá)70%(7/10)。應(yīng)用MSP、半巢式PCR兩種方法在40例對(duì)照組不同日齡(3,7,14,21d)的早產(chǎn)鼠均未發(fā)現(xiàn)有甲基化發(fā)生。隨著早產(chǎn)鼠暴露高氧時(shí)間的延長(zhǎng),甲基化發(fā)生率有增高趨勢(shì)。應(yīng)用半巢式和MSP技術(shù)檢測(cè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組肺組織p16基因甲基化發(fā)生率分別為52.5%和42.5%,但兩組方法比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 五、肺成纖維細(xì)胞的p16基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài) 對(duì)照組的各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)甲基化發(fā)生。在實(shí)驗(yàn)組,生后3d甲基化的發(fā)生率為16.67%,7d甲基化的發(fā)生率為33.33%,14d為50%,21d則達(dá)83.33%;與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.01)。 六、肺組織和肺成纖維細(xì)胞p16 mRNA表達(dá)水平 1、肺組織p16mRNA水平3d兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,7d實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組(P＜0.05)14,21d明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。暴露高氧后的40例早產(chǎn)鼠,發(fā)生甲基化共21例(半巢式PCR),與未發(fā)生甲基化19例相比,其p16 mRNA(RT-PCR技術(shù))及蛋白(Western-blot技術(shù))的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)。p16 mRNA及蛋白表達(dá)水平與甲基化相關(guān)。 2、肺成纖維細(xì)胞p16 mRNA表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較,生后3d,兩組p16mRNA水平無(wú)差異(P＞0.05),生后7d,實(shí)驗(yàn)組開始減少(P＜0.05),14d明顯減少(P＜0.01),21d達(dá)最低值(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組中發(fā)生甲基化的p16 mRNA表達(dá)與非甲基化的比較,差異顯著(P＜0.01),且p16 mRNA表達(dá)與甲基化相關(guān)(t=3.45,P＜0.01,OR=0.846)。 七、肺成纖維細(xì)胞p16、PCNA的蛋白表達(dá) 1、p16的蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較,生后3d,兩組p16的蛋白表達(dá)無(wú)差異(P＞0.05),生后7d,實(shí)驗(yàn)組開始減少(P＜0.05),14d明顯減少(P＜0.01),21d達(dá)最低值(P＜0.01)。 2、PCNA的蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較,生后3d,兩組無(wú)差異(P＞0.05),7d實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組(P＜0.01),14d持續(xù)增加,21d達(dá)高峰(P＜0.01)。肺成纖維細(xì)胞p16mRNA表達(dá)水平與PCNA表達(dá)在14、21d呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.886,P＜0.05;r=-0.928,P＜0.01)。 八、MTT法觀察肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)活力 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較,生后3d,兩組無(wú)差異(P＞0.05),7d實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組(P＜0.05),14d繼續(xù)升高,直至21d(P＜0.05)。 結(jié)論 1、暴露高氧中早產(chǎn)鼠,其肺組織的p16 mRNA及蛋白的表達(dá)水平降低,其低水平的表達(dá)狀態(tài)與高氧致CLD肺纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。 2、高氧可導(dǎo)致早產(chǎn)鼠的肺組織p16基因啟動(dòng)子的甲基化異常,且其甲基化的發(fā)生率隨高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。 3、高氧誘導(dǎo)的p16基因啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)可能是p16 mRNA及蛋白的低水平表達(dá)的機(jī)制之一。 4、高氧引發(fā)肺成纖維細(xì)胞的p16基因啟動(dòng)子甲基化而導(dǎo)致了p16基因表達(dá)水平低下,使肺成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控紊亂,最終肺成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖,可能是早產(chǎn)兒CLD的肺纖維化發(fā)生的機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R722.6

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本文編號(hào)：2694128