【摘要】： 第一章巨噬細胞NMDA受體表達及其高氧暴露的影響 目的:N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體是谷氨酸受體的重要亞型,NMDA受體(NMDAR)過度激活引起的興奮性神經(jīng)毒性是引起神經(jīng)細胞損傷的最后共同通路,在多種急慢性腦損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在外周非神經(jīng)組織對NMDA受體的研究較少,近年來發(fā)現(xiàn)NMDA受體在肺臟也有較高水平的表達,但生物學意義尚不清楚。 高氧性肺損傷是新生兒救治過程中的常見并發(fā)癥,嚴重影響新生兒的生存質量,但其發(fā)病機制尚未完全闡明。Said等首先報道NMDA可引起離體灌流肺發(fā)生高通透性肺水腫,他們進一步研究發(fā)現(xiàn),在成年大鼠肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage,AM)存在NMDA受體亞型NMDAR1及NMDAR2D的表達。本室前期研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)高氧暴露可致新生大鼠肺組織谷氨酸大量釋放、NMDA受體表達增強。申麗等近期研究表明,在整體水平上NMDA受體的激活具有肺毒性效應。但NMDA受體在新生大鼠和RAW264.7細胞的表達情況以及持續(xù)高氧暴露是否會引起NMDA受體表達變化還未有直接的證據(jù)。因此,本研究的目的是觀察NMDA受體各亞型在成年大鼠肺泡巨噬細胞、新生大鼠肺泡巨噬細胞和RAW264.7細胞的表達以及高氧暴露條件下新生大鼠肺泡巨噬細胞NMDA受體的表達變化。 方法: 1.支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage,BAL)分離、培養(yǎng)成年及新生大鼠肺泡巨噬細胞。 2.免疫細胞化學技術觀察在成年大鼠AM、空氣暴露新生大鼠AM、高氧暴露新生大鼠AM及RAW264.7細胞上NMDAR1蛋白的表達。 3.RT-PCR法檢測成年大鼠AM、空氣暴露新生大鼠AM、高氧暴露新生大鼠AM及RAW264.7細胞NMDAR1 mRNA的表達。 4.Real-time PCR法檢測成年大鼠AM、空氣暴露新生大鼠AM、高氧暴露新生大鼠AM及RAW264.7細胞NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、NMDAR2C、NMDAR2D的mRNA表達。 結果: 1.免疫細胞化學觀察到NMDAR1在4組細胞均有表達,新生大鼠AM中NMDAR1的表達明顯高于成年大鼠,持續(xù)高氧暴露后新生大鼠AM中NMDAR1的表達進一步增強,RAW264.7細胞NMDAR1的表達和成年AM無明顯差異。 2.RT-PCR法檢測到新生大鼠AM NMDAR1mRNA的表達明顯高于成年大鼠AM,持續(xù)高氧暴露后新生大鼠AM中NMDAR1mRNA的表達進一步增強,RAW264.7細胞NMDAR1mRNA的表達與成年大鼠AM無明顯差異。 3.Real-time PCR法檢測到NMDAR各亞型mRNA在4組細胞均有表達,以NMDAR2D表達最強,NMDAR1次之,NMDAR2C、NMDA2B和NMDA2A表達水平較低。新生大鼠AM NMDAR各亞型mRNA比成年大鼠AM有較高表達,高氧暴露后新生大鼠AM NMDAR各亞型mRNA的表達進一步增強。 結論: 1.在成年大鼠AM、新生大鼠AM及RAW264.7細胞上除有NMDAR1及NMDAR2D亞型的表達外,還存在NMDAR2A、NMDAR2B、NMDAR2C亞型的表達。 2.肺泡巨噬細胞NMDA受體呈年齡依賴性表達。 3.持續(xù)高氧暴露可以上調(diào)肺泡巨噬細胞NMDA受體各亞型的表達,提示肺泡巨噬細胞是NMDA受體參與高氧性肺損傷的重要靶細胞。 第二章NMDA受體激活對肺泡巨噬細胞一氧化氮產(chǎn)生及分泌的影響 目的:研究表明一氧化氮(nitric oxide,NO)在興奮性神經(jīng)毒性所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中起著關鍵的作用。Said等發(fā)現(xiàn)NMDA受體拮抗劑MK-801和一氧化氮合酶(NOS)抑制劑(L-NAME)可以減輕NMDA引起的離體肺高通透性肺水腫,表明NMDA在肺臟的損傷作用同樣也是NO依賴性的。本研究的目的在于觀察NMDA受體激活對離體培養(yǎng)的肺泡巨噬細胞NO的產(chǎn)生及分泌有何影響,進一步證明肺泡巨噬細胞通過NMDA受體的激活促進NO的產(chǎn)生和分泌,而參與高氧性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程。 方法: 1.用生化試劑盒測定不同濃度、不同時間NMDA干預對肺泡巨噬細胞產(chǎn)生及分泌NO的影響。 2.根據(jù)NO與NMDA的量效與時效關系,選擇適宜的NMDA干預條件對肺泡巨噬細胞進行干預后,對細胞的活力、細胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)活性及細胞提取物中丙二醛(MDA)含量進行測定。 3.用生化試劑盒檢測NMDA對肺泡巨噬細胞誘導型一氧化氮合酶(iNOS)活性的影響。 4.Real-time PCR法檢測NMDA對肺泡巨噬細胞iNOSmRNA的影響。 結果: 1.肺泡巨噬細胞分泌NO的量與NMDA有一定的劑量依賴性關系,隨著NMDA濃度的增加NO的量逐漸增多,NMDA 1μmol/L時NO的量達頂峰,NMDA 10μmol/L時NO的量較前明顯下降;肺泡巨噬細胞分泌NO的量與NMDA干預的時間有關,NMDA1μmol/L干預6h時NO的量達頂峰,干預8h時NO的量較前明顯下降。 2.1μmol/L NMDA干預肺泡巨噬細胞6h對細胞活力、LDH活性、MDA含量無明顯影響,表明此干預條件未對細胞造成損傷。 3.NMDA(1μmol/L)與肺泡巨噬細胞共培養(yǎng)6h,細胞iNOSmRNA表達及活性、細胞培養(yǎng)上清液中NO含量均較對照組明顯增高,MK-801(10μmol/L)預處理細胞30min后再給予NMDA干預,iNOSmRNA表達及活性、NO含量均較NMDA組明顯下降。 結論:NMDA受體激活可以增加肺泡巨噬細胞iNOS的轉錄,提高iNOS的活性,促進肺泡巨噬細胞NO的產(chǎn)生和分泌,表明肺泡巨噬細胞可能是肺損傷時NO增多的重要細胞來源。 第三章NMDA受體激活對肺泡巨噬細胞分泌促炎性細胞因子的影響 目的:本研究小組前期結果表明高氧性肺損傷時新生大鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2mRNA的表達及分泌明顯增加,MK-801可以抑制上述效應,表明在整體水平上,NMDA受體激活參與介導了高氧性肺損傷時肺內(nèi)促炎性細胞因子分泌增多的過程。本研究目的在于觀察NMDA對體外培養(yǎng)的大鼠肺泡巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2的影響,論證NMDA受體的激活可以促進肺泡巨噬細胞促炎性細胞因子的產(chǎn)生和分泌及肺泡巨噬細胞是高氧性肺損傷時促炎性細胞因子產(chǎn)生的重要來源的假說。 方法: 1.ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2含量。 2.Real-time PCR法檢測肺泡巨噬細胞TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2mRNA表達。 結果:NMDA可以上調(diào)肺泡巨噬細胞TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2mRNA表達及分泌,MK-801可以抑制上述效應。 結論:NMDA受體的激活能夠上調(diào)肺泡巨噬細胞促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2的表達并促進其分泌,表明肺泡巨噬細胞是高氧性肺損傷時促炎性細胞因子分泌增多的重要來源。 第四章NMDA受體激活促進肺泡巨噬細胞促炎性細胞因子產(chǎn)生和分泌機制的初步研究 目的:前文發(fā)現(xiàn),NMDA可促進肺泡巨噬細胞促炎性細胞因子的轉錄和分泌,但NMDA是通過何種信號轉導途徑影響促炎性細胞因子轉錄尚不清楚。在高氧性肺損傷的炎性反應過程中,NF-κB參與了肺泡巨噬細胞的活化,并控制著多種促炎性細胞因子的基因表達。細胞因子、NO等相互激發(fā)、相互影響在高氧性肺損傷過程中起著重要的作用。本研究將進一步探討NO、NF-κB在NMDA促進肺泡巨噬細胞促炎性細胞因子產(chǎn)生和分泌中的作用,以論證NF-κB是NMDA受體激活影響肺泡巨噬細胞促炎性細胞因子產(chǎn)生和分泌的重要信號轉導途徑的假說。 方法: 1.化學法測定細胞培養(yǎng)液中NO含量和細胞提取物iNOS活性,ELISA法、Real-time PCR法分別檢測細胞TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2含量及TNF-α、IL-1β、IL-6、MIP-2及iNOSmRNA表達,反映NO、NF-κB在NMDA促肺泡巨噬細胞促炎性細胞因子分泌中的作用。 2.Western Blot法測定NF-κBp65、I-κBα蛋白水平的變化,反映肺泡巨噬細胞NF-κB的激活。 3.凝膠滯留實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)測定肺泡巨噬細胞NF-κB與DNA的結合活性。 結果: 1.AG(iNOS選擇性抑制劑,100μmol/L)可以抑制NMDA誘導的肺泡巨噬細胞iNOS活性、NO含量、TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2mRNA及分泌的增加,但對iNOSmRNA表達無明顯影響。 2.SN50(NFκB轉錄因子的核轉位抑制劑,15μmol/L)可以抑制NMDA誘導的肺泡巨噬細胞iNOSmRNA表達及活性、NO含量、TNF-α、IL-1β、IL-6和MIP-2 mRNA及分泌的增加。 3.Western Blot實驗顯示NMDA可以通過促進肺泡巨噬細胞I-κBα的降解而激活NF-κB,MK-801、AG、SN50可以抑制NMDA誘導的I-κBα的降解及NF-κB的激活。 4.EMSA實驗顯示NMDA可以增強NF-κB的DNA結合活力,MK-801、AG、SN50可以抑制NMDA誘導的NF-κB DNA結合活力的增加。 結論:NF-κB是NMDA受體激活促進肺泡巨噬細胞促炎性細胞因子分泌過程中的重要轉錄調(diào)控因子,NO可能通過促進NF-κB的激活而增加促炎性細胞因子的分泌。
【圖文】：

一一 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 }}}}}}}}}{{{{{… … … {}{{{{{{{、、 }}}}}}}}}{}1111111}{川 川 川 川圖IR七 altimePCR擴增曲線圖2標準曲線1.2.6.6結果分析各樣本的目的基因和管家基因(Actin)分別進行 RealtimePCR反應。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標準曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結果直接由機器生成。每個樣品的目的基因濃度除以管家基因的濃度，即為此樣品該基因的校正后相對表達水平。 1.2.7統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差(x士s)表示，運用SPSS統(tǒng)計軟件對結果進行分析，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one， ayANOvA)比較各組差異性。檢驗水準 a=0.05

.2.6.5熒光定t陽R反應體系的配制:(總體積50卜l)ZXPCRbuffer25plPrimers(25pmol/pl)0.6p1xZ模板(cDNA)1plDEPC水22.8”1Total50pl熒光定量PCR擴增條件的設置:94oC4min，94oC155，60oC25s，72oC25s，循環(huán)40次定量PCR擴增曲線和標準曲線擴增曲線顯示各標準品每梯度之間相差2一3CT值，S形曲線形態(tài)較好。標準曲線顯示各梯度分布在同一直線上，其相關系數(shù)為0.99以上，認為可信。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R722.1

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本文編號：2691459