【摘要】： 前言 新生兒窒息是圍生期常見的對(duì)新生兒危害極大的疾病，是新生兒死亡和傷殘的主要病因之一，，本病致死致殘的主要原因是窒息缺氧造成多臟器(心、腦、腎、胃腸道等)損傷。國內(nèi)報(bào)道窒息后胃腸損害的發(fā)生率為33％，多于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。臨床上也注意到出生窒息后新生兒易合并胃腸道損害，甚至發(fā)生病死率極高的壞死性小腸結(jié)腸炎。雖然胃腸道并非所謂的生命器官，但由于它承擔(dān)著大部分消化吸收功能，對(duì)提供機(jī)體必要的能量和營養(yǎng)素需求，維持機(jī)體正常的新陳代謝和生長(zhǎng)發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。但對(duì)窒息后消化道粘膜屏障的成熟與完善，是否受損，損傷后的增殖修復(fù)能力如何，研究報(bào)道較少。 腸三葉因子(ITF)屬三葉肽家族，是近年來被人們注意到的對(duì)胃腸道粘膜屏障有重要保護(hù)和修復(fù)作用的多肽，是一種新型的生長(zhǎng)因子類多肽物質(zhì)。它的生理功能主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：首先ITF可與粘液糖蛋白相互作用或交聯(lián)，形成粘彈性的粘液凝膠層，對(duì)腸道粘液層起固定和支持作用，防止有害物質(zhì)對(duì)腸粘膜細(xì)胞的損傷，從而增強(qiáng)胃腸道粘膜屏障的保護(hù)能力；其次ITF具有很強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞增殖與移行的能力，被認(rèn)為是粘膜損傷的快速反應(yīng)肽，在損傷早期即可表達(dá)，促進(jìn)受損區(qū)域上皮細(xì)胞重建并加快上皮細(xì)胞移行速度，因而在腸道的自我保護(hù)機(jī)制中占據(jù)重要地位。 增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen PCNA)又稱周期蛋白。它是一種核內(nèi)蛋白質(zhì)，是DNA聚合酶的一個(gè)輔助蛋白，其合成和表達(dá)與細(xì)胞增殖有關(guān)，可能調(diào)節(jié)DNA復(fù)制。在正常增殖的組織和部分腫瘤組織中PCNA是人們所期望的理想的增殖 細(xì)胞標(biāo)志，目前許多研究項(xiàng)目已將PCNA列為一項(xiàng)常規(guī)檢測(cè)增生 細(xì)胞的方法。 本實(shí)驗(yàn)以宮內(nèi)窒息鼠為模型，采用RT－PCR及免疫組化方法 在分子和蛋白水平探討窒息后不同時(shí)間腸道中ITF的變化規(guī)律及 其與腸道損傷和修復(fù)的關(guān)系，以期了解窒息后新生兒消化道癥狀 產(chǎn)生的病理生理基礎(chǔ)，并闡明ITF保護(hù)腸粘膜的作用機(jī)制，為胃腸 疾病的預(yù)防治療提供一個(gè)新的思路。 材料與方法 一、動(dòng)物模型制備 妊娠足月p 天）孕鼠麻醉后下腹正中開腹，暴露雙角子宮及 供應(yīng)一側(cè)子宮和卵巢的動(dòng)靜脈血管，鉗夾20分鐘。以對(duì)測(cè)宮角內(nèi) 未鉗夾的胎鼠為對(duì)照組（假手術(shù)組八達(dá)到預(yù)定缺血時(shí)間后娩出 胎鼠，進(jìn)行窒息復(fù)蘇，建立正常呼吸，代乳鼠代乳。分別飼養(yǎng)0、 24戶8＊2小時(shí)后處死，留取樣本。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)留取5個(gè)標(biāo)本。 二、方法 1．用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT—PCR）法半定量檢測(cè)ITFmR－ NA的表達(dá)，以ITF的相對(duì)表達(dá)量即ITF／p－achn進(jìn)行計(jì)算。用免 疫組化技術(shù)檢測(cè)腸道PCNA蛋白表達(dá)，應(yīng)用Meta M。ph軟件測(cè)定 平均灰度。進(jìn)行常規(guī)HE染色，鏡下判定粘膜損害指數(shù)OMDI人 2．試劑jTF引物：由 Gene Bank查出全序列，由 PiIYun 5．0 軟件設(shè)計(jì)處理，連同p－actin引物均由北京奧科生物工程公司合 成；TRIZOL總 RNA提取試劑購自美國 promega公司；反轉(zhuǎn)錄和 PCR擴(kuò)增所需的酶和其它試劑均購自日本TaKaRa公司；PCNA免 疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)公司。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)用均值。標(biāo)準(zhǔn)差（X。s）表示，差異比 較采用SpS 10．0統(tǒng)計(jì)軟件的t檢驗(yàn)與 hD檢驗(yàn)＊檢驗(yàn)人并進(jìn) ·2· 行Speannan相關(guān)分析。 結(jié) 果 1．ITFm RN A正常在ZI日胎齡仔鼠已有一定表達(dá)，并隨日齡 的增加而逐漸增加，宮內(nèi)缺血缺氧后當(dāng)時(shí)ITFmRNA的表達(dá)即有 降低（0．86。0．043），到生后24小時(shí)降到最低點(diǎn)（0．59。0．032）， 48小時(shí)表達(dá)量有所增加（0．83。0．021），到生后72小時(shí)迅速增加 甚至超過對(duì)照組O．19。0．021人與相應(yīng)對(duì)照組相比差異顯著u ＜o(jì)．01人窒息后各時(shí)間點(diǎn)ITF’W A表達(dá)量比較亦差異顯著K＜ 0．of）。 2．正常ZI日胎齡仔鼠腸組織中即有PCNA蛋白的表達(dá)，表達(dá) 部位主要在腸粘膜杯狀細(xì)胞的胞核中，且陽性細(xì)胞集中于腸粘膜 隱窩處，絨毛頂端僅有少量表達(dá)。宮內(nèi)缺血缺氧20分鐘后，早期 PCNA表達(dá)即開始下降（56．75。l．18），24 ／J’時(shí)繼續(xù)下降（55．22 SZ．14），到48小時(shí)降到最低谷（53．29。二．97），72小時(shí)表達(dá)增加 并接近正常對(duì)照組抽1．SO土2．72入各時(shí)間點(diǎn)相比差異顯著矚＜ 0．of）。 3．鏡下可見正常ZI日齡胎鼠腸組織各層發(fā)育基本成熟，有絨 毛形成但較短，分支少，腸壁較薄，腸腺數(shù)量少，隨日齡的增加腸壁 各層逐步發(fā)育成熟。宮內(nèi)缺血缺氧復(fù)蘇后0小時(shí)，即發(fā)現(xiàn)部分腸 絨毛中軸固有層充血OMDI為0．67＊0．16X復(fù)蘇后24小時(shí)腸道 損傷進(jìn)一步加重OMDI為2．47。0．17入到48小時(shí)達(dá)到最重，絨 毛數(shù)量明顯減少，部分絨毛脫落，上皮細(xì)胞腫脹，變性、壞死、脫落， 固有層裸露，中軸固有層明顯充血、水腫，中央乳糜管擴(kuò)張，IMDI 也大幅度上升達(dá)門．40＊0．16人至日齡達(dá)到72小時(shí)，雖絨毛數(shù) 量較對(duì)照組仍略少，但上皮及間質(zhì)的改變已經(jīng)恢復(fù)，僅有局部毛細(xì) 血管略充血OMDI為＊60 L 0．ZI
【圖文】：

RT一PCR半定量檢測(cè)宮內(nèi)缺血缺氧20分鐘窒息復(fù)蘇后不同時(shí)間點(diǎn)的仔鼠腸組織ITFmRNA表達(dá)的變化，并與相應(yīng)對(duì)照組進(jìn)行比較，結(jié)果見表1及圖1，從表中可以看出:ITFrJ困A正常在21

(55.22土2.14)，到48小時(shí)降到最低谷(53.29土1.97)，72小時(shí)表達(dá)增加并接近正常對(duì)照組(61.80土2.72)，各時(shí)間點(diǎn)相比差異顯著，詳見表2及圖2。表2宮內(nèi)窒息后不同時(shí)間腸道PCNA表達(dá)的變化(又士s，n二15)0小時(shí)24小時(shí)48小時(shí)實(shí)驗(yàn)組56.75土1.18.‘55.22*2.14’.，53.29土1.97.對(duì)照組65.24士2.6766.17士2.1072.17土3.1972小時(shí).，61.80土2.720.奮74.48士0.1.33*與相應(yīng)對(duì)照組比較P<0.05**與相應(yīng)對(duì)照組比較P<0.01#各組間兩兩比較P<0.01nU0000000Q

本文編號(hào)：2683925