【摘要】： 前言 新生兒窒息是圍生期常見的對新生兒危害極大的疾病，是新生兒死亡和傷殘的主要病因之一，，本病致死致殘的主要原因是窒息缺氧造成多臟器(心、腦、腎、胃腸道等)損傷。國內報道窒息后胃腸損害的發(fā)生率為33％，多于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。臨床上也注意到出生窒息后新生兒易合并胃腸道損害，甚至發(fā)生病死率極高的壞死性小腸結腸炎。雖然胃腸道并非所謂的生命器官，但由于它承擔著大部分消化吸收功能，對提供機體必要的能量和營養(yǎng)素需求，維持機體正常的新陳代謝和生長發(fā)育起著至關重要的作用。但對窒息后消化道粘膜屏障的成熟與完善，是否受損，損傷后的增殖修復能力如何，研究報道較少。 腸三葉因子(ITF)屬三葉肽家族，是近年來被人們注意到的對胃腸道粘膜屏障有重要保護和修復作用的多肽，是一種新型的生長因子類多肽物質。它的生理功能主要體現(xiàn)在兩個方面：首先ITF可與粘液糖蛋白相互作用或交聯(lián)，形成粘彈性的粘液凝膠層，對腸道粘液層起固定和支持作用，防止有害物質對腸粘膜細胞的損傷，從而增強胃腸道粘膜屏障的保護能力；其次ITF具有很強的促進細胞增殖與移行的能力，被認為是粘膜損傷的快速反應肽，在損傷早期即可表達，促進受損區(qū)域上皮細胞重建并加快上皮細胞移行速度，因而在腸道的自我保護機制中占據(jù)重要地位。 增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen PCNA)又稱周期蛋白。它是一種核內蛋白質，是DNA聚合酶的一個輔助蛋白，其合成和表達與細胞增殖有關，可能調節(jié)DNA復制。在正常增殖的組織和部分腫瘤組織中PCNA是人們所期望的理想的增殖 細胞標志，目前許多研究項目已將PCNA列為一項常規(guī)檢測增生 細胞的方法。 本實驗以宮內窒息鼠為模型，采用RT－PCR及免疫組化方法 在分子和蛋白水平探討窒息后不同時間腸道中ITF的變化規(guī)律及 其與腸道損傷和修復的關系，以期了解窒息后新生兒消化道癥狀 產(chǎn)生的病理生理基礎，并闡明ITF保護腸粘膜的作用機制，為胃腸 疾病的預防治療提供一個新的思路。 材料與方法 一、動物模型制備 妊娠足月p 天）孕鼠麻醉后下腹正中開腹，暴露雙角子宮及 供應一側子宮和卵巢的動靜脈血管，鉗夾20分鐘。以對測宮角內 未鉗夾的胎鼠為對照組（假手術組八達到預定缺血時間后娩出 胎鼠，進行窒息復蘇，建立正常呼吸，代乳鼠代乳。分別飼養(yǎng)0、 24戶8＊2小時后處死，留取樣本。每個時間點留取5個標本。 二、方法 1．用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT—PCR）法半定量檢測ITFmR－ NA的表達，以ITF的相對表達量即ITF／p－achn進行計算。用免 疫組化技術檢測腸道PCNA蛋白表達，應用Meta M。ph軟件測定 平均灰度。進行常規(guī)HE染色，鏡下判定粘膜損害指數(shù)OMDI人 2．試劑jTF引物：由 Gene Bank查出全序列，由 PiIYun 5．0 軟件設計處理，連同p－actin引物均由北京奧科生物工程公司合 成；TRIZOL總 RNA提取試劑購自美國 promega公司；反轉錄和 PCR擴增所需的酶和其它試劑均購自日本TaKaRa公司；PCNA免 疫組化試劑盒購自北京中山生物技術公司。 統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)用均值。標準差（X。s）表示，差異比 較采用SpS 10．0統(tǒng)計軟件的t檢驗與 hD檢驗＊檢驗人并進 ·2· 行Speannan相關分析。 結 果 1．ITFm RN A正常在ZI日胎齡仔鼠已有一定表達，并隨日齡 的增加而逐漸增加，宮內缺血缺氧后當時ITFmRNA的表達即有 降低（0．86。0．043），到生后24小時降到最低點（0．59。0．032）， 48小時表達量有所增加（0．83。0．021），到生后72小時迅速增加 甚至超過對照組O．19。0．021人與相應對照組相比差異顯著u ＜o．01人窒息后各時間點ITF’W A表達量比較亦差異顯著K＜ 0．of）。 2．正常ZI日胎齡仔鼠腸組織中即有PCNA蛋白的表達，表達 部位主要在腸粘膜杯狀細胞的胞核中，且陽性細胞集中于腸粘膜 隱窩處，絨毛頂端僅有少量表達。宮內缺血缺氧20分鐘后，早期 PCNA表達即開始下降（56．75。l．18），24 ／J’時繼續(xù)下降（55．22 SZ．14），到48小時降到最低谷（53．29。二．97），72小時表達增加 并接近正常對照組抽1．SO土2．72入各時間點相比差異顯著矚＜ 0．of）。 3．鏡下可見正常ZI日齡胎鼠腸組織各層發(fā)育基本成熟，有絨 毛形成但較短，分支少，腸壁較薄，腸腺數(shù)量少，隨日齡的增加腸壁 各層逐步發(fā)育成熟。宮內缺血缺氧復蘇后0小時，即發(fā)現(xiàn)部分腸 絨毛中軸固有層充血OMDI為0．67＊0．16X復蘇后24小時腸道 損傷進一步加重OMDI為2．47。0．17入到48小時達到最重，絨 毛數(shù)量明顯減少，部分絨毛脫落，上皮細胞腫脹，變性、壞死、脫落， 固有層裸露，中軸固有層明顯充血、水腫，中央乳糜管擴張，IMDI 也大幅度上升達門．40＊0．16人至日齡達到72小時，雖絨毛數(shù) 量較對照組仍略少，但上皮及間質的改變已經(jīng)恢復，僅有局部毛細 血管略充血OMDI為＊60 L 0．ZI
【圖文】：

RT一PCR半定量檢測宮內缺血缺氧20分鐘窒息復蘇后不同時間點的仔鼠腸組織ITFmRNA表達的變化，并與相應對照組進行比較，結果見表1及圖1，從表中可以看出:ITFrJ困A正常在21

(55.22土2.14)，到48小時降到最低谷(53.29土1.97)，72小時表達增加并接近正常對照組(61.80土2.72)，各時間點相比差異顯著，詳見表2及圖2。表2宮內窒息后不同時間腸道PCNA表達的變化(又士s，n二15)0小時24小時48小時實驗組56.75土1.18.‘55.22*2.14’.，53.29土1.97.對照組65.24士2.6766.17士2.1072.17土3.1972小時.，61.80土2.720.奮74.48士0.1.33*與相應對照組比較P<0.05**與相應對照組比較P<0.01#各組間兩兩比較P<0.01nU0000000Q

本文編號：2683925