【摘要】：呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是全世界范圍內引起嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病原體,容易誘發(fā)毛細支氣管炎、肺炎,甚至導致死亡。迄今為止,仍然沒有一種安全有效的疫苗來預防RSV感染。在本研究中,將呼吸道合胞病毒F1蛋白與結核分枝桿菌TB10.4蛋白在大腸桿菌中進行了融合表達,并輔以粘膜佐劑無毒型大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(E.coli heat-labile enterotoxin, LT)后免疫BALB/c小鼠,以此來分析和評價融合蛋白的免疫原性及其安全性。 為獲得重組TB10.4-F1融合蛋白,構建了TB10.4-F1/pET30a重組載體,同時構建TB10.4/pET28a載體以作對照。轉化大腸桿菌后成功表達出了含有His標簽的TB10.4-F1蛋白和TB10.4蛋白。anti-His作一抗Western-blot鑒定重組蛋白正確。大量誘導表達并獲得目的蛋白的包涵體之后,在變性條件下用鎳親和層析的方法一步純化,純化后TB10.4-F1和TB10.4的純度分別達到80%和95%。 將純化后的TB10.4-F1蛋白、TB10.4蛋白分別與LT混合后免疫BALB/c小鼠,設立PBS組；LT組；TB10.4組；TB10.4-F1組；TB10.4-F1+LT組,共5組,每組5只,按照0、2、4周免疫程序免疫。免疫周期結束后處死測定各項指標。結果表明：1)TB10.4-F1組和TB10.4-F1+LT組的特異性IgG水平顯著高于其它對照組,說明融合蛋白可以刺激產生高水平的血清抗體；2)與TB10.4組相比,TB10.4-F1組和TB10.4-F1+LT組的IgGl/IgG2a比值更接近1,T細胞免疫反應較為平衡；3)肺組織病理切片表明,TB10.4-F1融合蛋白具有一定的免疫毒性,會造成肺組織中毛細血管擴張,嗜酸粒細胞增多；4)TB10.4組IgG1/IgG2a比值大于1,代表Th2型反應占優(yōu)勢。 隨后按同樣分組免疫小鼠,免疫周期結束后,用3×105pfu的RSV滴鼻攻擊免疫后的小鼠,5天之后處死測定各項指標。結果表明：1)攻毒后,TB10.4-F1+LT組和TB10.4-F1組小鼠體重下降迅速,特別是TB10.4-F1+LT組小鼠在處死前由于呼吸衰竭已死亡3只；2)TB10.4-F1+LT組和TB10.4-F1組的呼吸道灌洗液中均有IgA反應,并且TB10.4-F1+LT組IgA值又明顯大于TB10.4-F1組(P0.05),說明LT的加入可以促進呼吸道粘膜處產生分泌型IgA；3)肺組織病理切片表明,攻毒后TB10.4-F1+LT組和TB10.4-F1組小鼠機體會引發(fā)嚴重的免疫毒理反應,說明重組TB10.4-F1蛋白存在免疫毒性,不僅沒有保護作用,反而會加重小鼠病情。 本實驗初步探討了融合蛋白TB10.4-F1的免疫原性及其安全性,為以后新型RSV疫苗的研發(fā)提供了理論依據。
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R725.6

【參考文獻】

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本文編號：2683297