發(fā)布時間：2020-05-25 23:45

【摘要】：第一部分Abp1在調(diào)控足細胞功能中的作用及機制初探第一節(jié)Abp1在足細胞中的表達及功能目的:探討Abp1是否在腎臟組織及足細胞中有表達,及Abp1對足細胞功能的影響。方法:通過RT-PCR及免疫熒光檢測Abp1在腎臟組織及足細胞的表達;免疫熒光檢測Abp1與F-actin的空間位置關(guān)系;構(gòu)建Abp1過表達慢病毒質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染慢病毒,獲得Abp1過表達細胞株,并用Q-PCR及western blot檢測Abp1的m RNA及蛋白水平變化;CCK8檢測過表達Abp1增殖活性;流式細胞術(shù)檢測足細胞凋亡;結(jié)晶紫染色檢測足細胞粘附功能;Q-PCR檢測足細胞podocin及nephrin的m RNA表達。結(jié)果:腎臟組織及足細胞特異性表達Abp1,Abp1分布于足細胞胞漿,與F-actin有共定。與對照組比較,Abp1過表達組的Abp1的m RNA及蛋白水平明顯增加(P0.05);與對照組相比,過表達組的增殖活性降低,凋亡增加,粘附功能降低,F-actin骨架結(jié)構(gòu)破壞(P均0.05);與對照組相比,Abp1過表達、podocin及nephrin的m RNA表達水平間無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:Abp1在腎臟局部及足細胞有表達,過表達Abp1對足細胞的增殖、凋亡及粘附功能有影響。第二節(jié)Abp1調(diào)控足細胞功能的機制研究目的:初步探討Abp1調(diào)控細胞形態(tài)、增殖、凋亡的潛在機制。方法:流式細胞術(shù)檢測足細胞周期,Q-PCR檢測細胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、P27等蛋白變化;Q-PCR檢測YAP及dendrin的表達;western blot及pull down檢測Rho A表達及活性;免疫熒光檢測Abp1與Arp2/3、N-wasp在足細胞的空間位置關(guān)系;鬼筆環(huán)肽染色檢測足細胞骨架結(jié)構(gòu)F-actin;Q-PCR及western blot檢測LPS誘導的足細胞損傷模型中Abp1、Rho A、YAP、dendrin等蛋白的表達。結(jié)果:與正常組相比,Abp1過表達組細胞周期停滯在S期,細胞周期蛋白cyclin D1表達降低,P27表達上調(diào)(P均0.05);與正常對照組相比,過表達Abp1可使YAP表達降低,dendrin表達增加,Rho A表達減少,活性降低,且足細胞骨架結(jié)構(gòu)F-actin破壞(P均0.05);Abp1與Arp2/3、Abp1與N-wasp共定位足細胞胞漿;與正常對照組相比,LPS組Abp1表達增加,Rho A表達下降,活性降低,且YAP表達降低,dendrin表達增加(P均0.05)。結(jié)論:Abp1可能通過調(diào)節(jié)cyclin D1及P 27的表達,使足細胞周期停滯在S期,抑制細胞增殖;Abp1可能通過調(diào)控Rho A-YAP-dendrin促進細胞凋亡;Abp1可能通過調(diào)控N-wasp/Arp2/3復(fù)合體影響足細胞足突結(jié)構(gòu);LPS可能通過上調(diào)Abp1表達抑制Rho A酶活性,促進足細胞凋亡。第二部分IL-17A活化ROS-NLRP3-caspase-1軸介導足細胞損傷的機制研究目的:體外IL-17A刺激干預(yù)足細胞,探討IL-17A誘導足細胞損傷的潛在機制。方法:細胞分為5組,正常對照組,IL-17A組,IL-17RA組,NAC組及YVAD組。Q-PCR及western blot檢測足細胞NLRP3、caspase-1、podocin及desmin的表達,流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS水平,比色法檢測caspase-1活性,ELISA檢測足細胞分泌IL-1β的分泌水平變化,鬼筆環(huán)肽染色細胞骨架F-actin。結(jié)果:與對照組相比,IL-17A組NLRP3、caspase-1的表達增加,且呈現(xiàn)時間劑量依賴性,caspase-1活性及IL-1β分泌水平增加,胞內(nèi)ROS水平增加,desmin表達增加,podocin表達下降,F-actin骨架結(jié)構(gòu)破壞(P0.05)。與IL-17A組相比,IL-17RA組胞內(nèi)ROS水平降低,NLRP3及caspase-1基因表達下降(P0.05)。與IL-17A相比,NAC組胞內(nèi)ROS水平降低,caspase-1活性及IL-1β分泌水平降低,desmin表達降低,podocin表達增加,F-actin骨架纖維絲增加(P0.05)。與IL-17A組相比,YVAD組caspase-1活性及IL-1β分泌水平降低,desmin表達降低,podocin表達增加,F-actin骨架纖維絲增加(P0.05)。結(jié)論:IL-17A可以通過活化ROS-NLRP3-caspase-1軸誘導足細胞分泌IL-1β從而介導足細胞損傷。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R726.9

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