【摘要】：第一部分Abp1在調(diào)控足細(xì)胞功能中的作用及機(jī)制初探第一節(jié)Abp1在足細(xì)胞中的表達(dá)及功能目的:探討Abp1是否在腎臟組織及足細(xì)胞中有表達(dá),及Abp1對(duì)足細(xì)胞功能的影響。方法:通過(guò)RT-PCR及免疫熒光檢測(cè)Abp1在腎臟組織及足細(xì)胞的表達(dá);免疫熒光檢測(cè)Abp1與F-actin的空間位置關(guān)系;構(gòu)建Abp1過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染慢病毒,獲得Abp1過(guò)表達(dá)細(xì)胞株,并用Q-PCR及western blot檢測(cè)Abp1的m RNA及蛋白水平變化;CCK8檢測(cè)過(guò)表達(dá)Abp1增殖活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)足細(xì)胞凋亡;結(jié)晶紫染色檢測(cè)足細(xì)胞粘附功能;Q-PCR檢測(cè)足細(xì)胞podocin及nephrin的m RNA表達(dá)。結(jié)果:腎臟組織及足細(xì)胞特異性表達(dá)Abp1,Abp1分布于足細(xì)胞胞漿,與F-actin有共定。與對(duì)照組比較,Abp1過(guò)表達(dá)組的Abp1的m RNA及蛋白水平明顯增加(P0.05);與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)組的增殖活性降低,凋亡增加,粘附功能降低,F-actin骨架結(jié)構(gòu)破壞(P均0.05);與對(duì)照組相比,Abp1過(guò)表達(dá)、podocin及nephrin的m RNA表達(dá)水平間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:Abp1在腎臟局部及足細(xì)胞有表達(dá),過(guò)表達(dá)Abp1對(duì)足細(xì)胞的增殖、凋亡及粘附功能有影響。第二節(jié)Abp1調(diào)控足細(xì)胞功能的機(jī)制研究目的:初步探討Abp1調(diào)控細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡的潛在機(jī)制。方法:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)足細(xì)胞周期,Q-PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、P27等蛋白變化;Q-PCR檢測(cè)YAP及dendrin的表達(dá);western blot及pull down檢測(cè)Rho A表達(dá)及活性;免疫熒光檢測(cè)Abp1與Arp2/3、N-wasp在足細(xì)胞的空間位置關(guān)系;鬼筆環(huán)肽染色檢測(cè)足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)F-actin;Q-PCR及western blot檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型中Abp1、Rho A、YAP、dendrin等蛋白的表達(dá)。結(jié)果:與正常組相比,Abp1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞周期停滯在S期,細(xì)胞周期蛋白cyclin D1表達(dá)降低,P27表達(dá)上調(diào)(P均0.05);與正常對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)Abp1可使YAP表達(dá)降低,dendrin表達(dá)增加,Rho A表達(dá)減少,活性降低,且足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)F-actin破壞(P均0.05);Abp1與Arp2/3、Abp1與N-wasp共定位足細(xì)胞胞漿;與正常對(duì)照組相比,LPS組Abp1表達(dá)增加,Rho A表達(dá)下降,活性降低,且YAP表達(dá)降低,dendrin表達(dá)增加(P均0.05)。結(jié)論:Abp1可能通過(guò)調(diào)節(jié)cyclin D1及P 27的表達(dá),使足細(xì)胞周期停滯在S期,抑制細(xì)胞增殖;Abp1可能通過(guò)調(diào)控Rho A-YAP-dendrin促進(jìn)細(xì)胞凋亡;Abp1可能通過(guò)調(diào)控N-wasp/Arp2/3復(fù)合體影響足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu);LPS可能通過(guò)上調(diào)Abp1表達(dá)抑制Rho A酶活性,促進(jìn)足細(xì)胞凋亡。第二部分IL-17A活化ROS-NLRP3-caspase-1軸介導(dǎo)足細(xì)胞損傷的機(jī)制研究目的:體外IL-17A刺激干預(yù)足細(xì)胞,探討IL-17A誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的潛在機(jī)制。方法:細(xì)胞分為5組,正常對(duì)照組,IL-17A組,IL-17RA組,NAC組及YVAD組。Q-PCR及western blot檢測(cè)足細(xì)胞NLRP3、caspase-1、podocin及desmin的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平,比色法檢測(cè)caspase-1活性,ELISA檢測(cè)足細(xì)胞分泌IL-1β的分泌水平變化,鬼筆環(huán)肽染色細(xì)胞骨架F-actin。結(jié)果:與對(duì)照組相比,IL-17A組NLRP3、caspase-1的表達(dá)增加,且呈現(xiàn)時(shí)間劑量依賴性,caspase-1活性及IL-1β分泌水平增加,胞內(nèi)ROS水平增加,desmin表達(dá)增加,podocin表達(dá)下降,F-actin骨架結(jié)構(gòu)破壞(P0.05)。與IL-17A組相比,IL-17RA組胞內(nèi)ROS水平降低,NLRP3及caspase-1基因表達(dá)下降(P0.05)。與IL-17A相比,NAC組胞內(nèi)ROS水平降低,caspase-1活性及IL-1β分泌水平降低,desmin表達(dá)降低,podocin表達(dá)增加,F-actin骨架纖維絲增加(P0.05)。與IL-17A組相比,YVAD組caspase-1活性及IL-1β分泌水平降低,desmin表達(dá)降低,podocin表達(dá)增加,F-actin骨架纖維絲增加(P0.05)。結(jié)論:IL-17A可以通過(guò)活化ROS-NLRP3-caspase-1軸誘導(dǎo)足細(xì)胞分泌IL-1β從而介導(dǎo)足細(xì)胞損傷。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R726.9

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本文編號(hào)：2680926