【摘要】：第一部分:不同濃度過氧化氫對A549細胞p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3的影響目的通過建立不同濃度過氧化氫(H_2O_2)干預的A549細胞模型,探討不同濃度H_2O_2對A549細胞p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3蛋白表達的影響。方法不同濃度H_2O_2干預A549細胞12h,采用MTT、CCK8和LDH法檢測A549細胞活力和受抑情況,Western blot法檢測p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3蛋白表達。結(jié)果1.隨著H_2O_2濃度提高和作用時間延長,A549細胞存活率呈濃度、時間依賴方式下降。結(jié)合CCK8、MTT和LDH結(jié)果,選擇H_2O_2干預12h作為后續(xù)研究干預時間,這樣既可對A549細胞產(chǎn)生較明顯影響,同時又不會對細胞造成太大傷害影響后續(xù)實驗結(jié)果。2.不同濃度H_2O_2干預A549細胞12h,與對照組(H_2O_2濃度為0umol/L)相比,隨著H_2O_2濃度增加,p-p38、MKP-1蛋白表達水平呈逐漸升高趨勢,當H_2O_2濃度增高至400umol/L時,p-p38、MKP-1蛋白表達量與對照組差異顯著(p0.01);隨著H_2O_2濃度的增加,HDAC-1、-2、-3蛋白表達水平呈逐漸降低趨勢,HDAC-1、-2、-3對H_2O_2濃度敏感性不同,當H_2O_2濃度增加至100umol/L時,HDAC-1表達與對照組差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),增加至200umol/L時,HDAC-3表達與對照組差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),增加至400umol/L時,HDAC-2表達量與對照組差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結(jié)論通過建立氧化應激性肺損傷A549細胞模型,初步證實p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3參與肺細胞氧化應激性損傷過程。第二部分:過氧化氫、維甲酸對A549細胞p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3表達的影響目的建立H_2O_2和維甲酸(RA)干預的A549細胞模型,探討H_2O_2和RA對A549細胞p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3蛋白表達的影響。方法取對數(shù)生長期A549細胞隨機分為4組(對照組、H_2O_2組、RA組、H_2O_2+RA組)干預8、12、24h,采用Western blot法檢測p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3蛋白表達,流式細胞儀檢測A549細胞早期凋亡、晚期凋亡和壞死情況。結(jié)果1.RA和H_2O_2干預A549細胞8、12、24h,干預時間為8h時,與對照組比較,H_2O_2組p-p38蛋白表達水平顯著增高(p0.05),RA可使H_2O_2干預后的A549細胞p-p38蛋白表達部分降低,但與H_2O_2組相比差異不顯著(p0.05);RA組和H_2O_2組MKP-1蛋白表達水平均顯著升高(p0.01),兩者同時使用時MKP-1表達進一步增高,與H_2O_2組相比差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01);H_2O_2組HDAC-1、-2、-3表達水平不同程度降低(p0.05),RA可使H_2O_2干預后的A549細胞蛋白HDAC-1、-2表達增高,與H_2O_2組相比差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),但對HDAC-3蛋白促表達作用未見明顯統(tǒng)計學差異(p0.05)。干預時間為12、24h時,與對照組相比,H_2O_2組p-p38蛋白表達水平顯著增高(p0.01),RA可使H_2O_2干預后的A549細胞p-p38蛋白表達顯著降低(p0.05);MKP-1蛋白表達趨勢基本與8h一致;H_2O_2組HDAC-1、-2、-3表達水平不同程度降低(p0.01),RA可使H_2O_2干預后的A549細胞蛋白HDAC-1、-2、-3表達部分增高,與H_2O_2組相比差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。2.RA和H_2O_2干預A549細胞8、12、24h,干預時間為8h時,與對照組比較,H_2O_2可使早期凋亡細胞明顯增加(p0.01),晚期凋亡+死亡細胞增加不顯著(p0.05),RA對H_2O_2誘導凋亡的細胞未見明顯保護作用(p0.05);干預時間延長至12、24h時,H_2O_2使早期凋亡細胞和晚期凋亡+壞死細胞均明顯增加(p0.001),RA可部分逆轉(zhuǎn)H_2O_2干預所導致的細胞凋亡、壞死,與H_2O_2組相比差異具有統(tǒng)計學意義(p0.001)。結(jié)論初步證實RA可通過調(diào)控HDACs和MKP-1表達,調(diào)節(jié)p38 MAPKs信號通路活性,在肺細胞氧化應激性損傷中發(fā)揮保護作用。
【圖文】：

圖 3 相差顯微鏡下胎鼠 AECII 體外培養(yǎng) 2d ×100A 對 AECII MKP-1 和 HDAC-1、-2、-3 蛋白表達的ECII 細胞隨機分成 4 組（對照組、H2O2組、RA 組和 H別用 400umol/L H2O2和 10-6mol/L RA 干預 12h，采KP-1 和 HDAC-1、-2、-3 蛋白表達水平，結(jié)果顯示：與 MKP-1 表達升高，，RA 則對 ACEII MKP-1 表達沒有明AC-1、-2、-3 表達水平均有不同程度升高，H2O2使，但對 HDAC-1、-3 表達無明顯影響；RA 使 H2O2干表達部分升高，但對 HDAC-1、-3 影響不明顯（見圖 ECII 產(chǎn)量較低，且無法增殖傳代，不能滿足大量實驗ECII 特征的 A549 細胞完成后續(xù)實驗。

圖 6-1H2O2組 vs.對照組， ** p <0.01圖 6-2① 圖 6-2② 圖 6-2③ 圖 6-2④圖 6-2 干預時間為 8h，圖①、②、③、④依次為對照組、RA 組、H2O22+RA 組Annexin V
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R722.6

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