【摘要】：第一部分:不同濃度過(guò)氧化氫對(duì)A549細(xì)胞p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3的影響目的通過(guò)建立不同濃度過(guò)氧化氫(H_2O_2)干預(yù)的A549細(xì)胞模型,探討不同濃度H_2O_2對(duì)A549細(xì)胞p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3蛋白表達(dá)的影響。方法不同濃度H_2O_2干預(yù)A549細(xì)胞12h,采用MTT、CCK8和LDH法檢測(cè)A549細(xì)胞活力和受抑情況,Western blot法檢測(cè)p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3蛋白表達(dá)。結(jié)果1.隨著H_2O_2濃度提高和作用時(shí)間延長(zhǎng),A549細(xì)胞存活率呈濃度、時(shí)間依賴方式下降。結(jié)合CCK8、MTT和LDH結(jié)果,選擇H_2O_2干預(yù)12h作為后續(xù)研究干預(yù)時(shí)間,這樣既可對(duì)A549細(xì)胞產(chǎn)生較明顯影響,同時(shí)又不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成太大傷害影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.不同濃度H_2O_2干預(yù)A549細(xì)胞12h,與對(duì)照組(H_2O_2濃度為0umol/L)相比,隨著H_2O_2濃度增加,p-p38、MKP-1蛋白表達(dá)水平呈逐漸升高趨勢(shì),當(dāng)H_2O_2濃度增高至400umol/L時(shí),p-p38、MKP-1蛋白表達(dá)量與對(duì)照組差異顯著(p0.01);隨著H_2O_2濃度的增加,HDAC-1、-2、-3蛋白表達(dá)水平呈逐漸降低趨勢(shì),HDAC-1、-2、-3對(duì)H_2O_2濃度敏感性不同,當(dāng)H_2O_2濃度增加至100umol/L時(shí),HDAC-1表達(dá)與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),增加至200umol/L時(shí),HDAC-3表達(dá)與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),增加至400umol/L時(shí),HDAC-2表達(dá)量與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論通過(guò)建立氧化應(yīng)激性肺損傷A549細(xì)胞模型,初步證實(shí)p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3參與肺細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷過(guò)程。第二部分:過(guò)氧化氫、維甲酸對(duì)A549細(xì)胞p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3表達(dá)的影響目的建立H_2O_2和維甲酸(RA)干預(yù)的A549細(xì)胞模型,探討H_2O_2和RA對(duì)A549細(xì)胞p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3蛋白表達(dá)的影響。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞隨機(jī)分為4組(對(duì)照組、H_2O_2組、RA組、H_2O_2+RA組)干預(yù)8、12、24h,采用Western blot法檢測(cè)p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3蛋白表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和壞死情況。結(jié)果1.RA和H_2O_2干預(yù)A549細(xì)胞8、12、24h,干預(yù)時(shí)間為8h時(shí),與對(duì)照組比較,H_2O_2組p-p38蛋白表達(dá)水平顯著增高(p0.05),RA可使H_2O_2干預(yù)后的A549細(xì)胞p-p38蛋白表達(dá)部分降低,但與H_2O_2組相比差異不顯著(p0.05);RA組和H_2O_2組MKP-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高(p0.01),兩者同時(shí)使用時(shí)MKP-1表達(dá)進(jìn)一步增高,與H_2O_2組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);H_2O_2組HDAC-1、-2、-3表達(dá)水平不同程度降低(p0.05),RA可使H_2O_2干預(yù)后的A549細(xì)胞蛋白HDAC-1、-2表達(dá)增高,與H_2O_2組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),但對(duì)HDAC-3蛋白促表達(dá)作用未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。干預(yù)時(shí)間為12、24h時(shí),與對(duì)照組相比,H_2O_2組p-p38蛋白表達(dá)水平顯著增高(p0.01),RA可使H_2O_2干預(yù)后的A549細(xì)胞p-p38蛋白表達(dá)顯著降低(p0.05);MKP-1蛋白表達(dá)趨勢(shì)基本與8h一致;H_2O_2組HDAC-1、-2、-3表達(dá)水平不同程度降低(p0.01),RA可使H_2O_2干預(yù)后的A549細(xì)胞蛋白HDAC-1、-2、-3表達(dá)部分增高,與H_2O_2組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.RA和H_2O_2干預(yù)A549細(xì)胞8、12、24h,干預(yù)時(shí)間為8h時(shí),與對(duì)照組比較,H_2O_2可使早期凋亡細(xì)胞明顯增加(p0.01),晚期凋亡+死亡細(xì)胞增加不顯著(p0.05),RA對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞未見(jiàn)明顯保護(hù)作用(p0.05);干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)至12、24h時(shí),H_2O_2使早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡+壞死細(xì)胞均明顯增加(p0.001),RA可部分逆轉(zhuǎn)H_2O_2干預(yù)所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡、壞死,與H_2O_2組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。結(jié)論初步證實(shí)RA可通過(guò)調(diào)控HDACs和MKP-1表達(dá),調(diào)節(jié)p38 MAPKs信號(hào)通路活性,在肺細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 3 相差顯微鏡下胎鼠 AECII 體外培養(yǎng) 2d ×100A 對(duì) AECII MKP-1 和 HDAC-1、-2、-3 蛋白表達(dá)的ECII 細(xì)胞隨機(jī)分成 4 組（對(duì)照組、H2O2組、RA 組和 H別用 400umol/L H2O2和 10-6mol/L RA 干預(yù) 12h，采KP-1 和 HDAC-1、-2、-3 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與 MKP-1 表達(dá)升高，，RA 則對(duì) ACEII MKP-1 表達(dá)沒(méi)有明AC-1、-2、-3 表達(dá)水平均有不同程度升高，H2O2使，但對(duì) HDAC-1、-3 表達(dá)無(wú)明顯影響；RA 使 H2O2干表達(dá)部分升高，但對(duì) HDAC-1、-3 影響不明顯（見(jiàn)圖 ECII 產(chǎn)量較低，且無(wú)法增殖傳代，不能滿足大量實(shí)驗(yàn)ECII 特征的 A549 細(xì)胞完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 6-1H2O2組 vs.對(duì)照組， ** p <0.01圖 6-2① 圖 6-2② 圖 6-2③ 圖 6-2④圖 6-2 干預(yù)時(shí)間為 8h，圖①、②、③、④依次為對(duì)照組、RA 組、H2O22+RA 組Annexin V
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R722.6

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本文編號(hào)：2678886