發(fā)布時(shí)間：2020-05-19 12:21

【摘要】：研究背景甲狀腺功能減退癥是因?yàn)榧谞钕偎胤置诓蛔愣l(fā)生的內(nèi)分泌疾病,是兒科最常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病之一。目前已知甲狀腺炎癥損傷是獲得性甲減的最常見(jiàn)病因,但甲狀腺炎的具體病理學(xué)機(jī)制并不清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long noncoding RNAs,IncRNAs)和微小RNA(microRNAs，miRNAs)具有復(fù)雜多樣的生物學(xué)功能,能夠調(diào)控許多疾病的發(fā)生。研究目的本研究通過(guò)脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)誘導(dǎo)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞系Nthy-ori-3.1發(fā)生炎癥損傷,以此來(lái)探究IncRNA-H19在Nthy-ori-3.1細(xì)胞炎癥損傷中的作用和機(jī)制,為進(jìn)一步闡明甲狀腺炎癥損傷的病理學(xué)機(jī)理和對(duì)甲減進(jìn)行有效的治療與干預(yù)提供新的依據(jù)。研究方法第二章LPS誘導(dǎo)Nthy-ori-3.1細(xì)胞增殖抑制、凋亡和炎癥因子過(guò)表達(dá)損傷將Nthy-ori-3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)接到添加了 10%的胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的正常的RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640)培養(yǎng)基中,在含有95%的空氣和5%的二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行37℃常規(guī)培養(yǎng)。以此條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞作“對(duì)照組”。向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加10 ng/ml的LPS,在與“對(duì)照組”相同的培養(yǎng)條件下處理細(xì)胞12個(gè)小時(shí),以此作為“LPS處理組”。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)實(shí)驗(yàn)方法分別檢測(cè)“對(duì)照組”和“LPS處理組”中Nthy-ori-3.1細(xì)胞的活力。通過(guò)異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate，F(xiàn)ITC)偶聯(lián)膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(Propidium iodide,PI)雙染色法(Annexin V-FITC/PI)和流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)分別檢測(cè)了“對(duì)照組”和“LPS處理組”Nthy-ori-3.1細(xì)胞的凋亡率。以β-actin作內(nèi)參,利用蛋白質(zhì)免疫印跡法分別檢測(cè)了兩個(gè)組份細(xì)胞中的凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Pro/Cleaved-caspase3 以及炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素 1β(Interleukin-1,IL-1β)、IL-6、單核細(xì)胞趨化因子 1(Monocyte chemoattractant proteinl,MCP-1)的蛋白表達(dá)情況,并利用Image LabTM圖像處理軟件分別對(duì)Bax、Bcl-2和Cleaved-caspase 3的蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行了量化分析。以GADPH作內(nèi)參,使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了“對(duì)照組”和“LPS處理組”細(xì)胞中的IL-lβ、IL-6、MCP-1在RNA水平上的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定了各處理組細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的實(shí)際含量。使用Graphpad統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并計(jì)算尸值。兩組之間使用t-test或單因素方差分析法(One-way analysis of variance，ANOVA)進(jìn)行差異性比較。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。第三章過(guò)表達(dá)IncRNA-H19緩解LPS誘導(dǎo)的Nthy-ori-3.1細(xì)胞增殖抑制、凋亡和炎癥因子過(guò)表達(dá)損傷本實(shí)驗(yàn)克隆合成了lncRNA-H19片段,并利用pEX-2質(zhì)粒構(gòu)建了1ncRNA-H19的過(guò)表達(dá)載體pEX-H19。利用lipofectamine 3000試劑將pEX-H19及其陰性對(duì)照(pEX-2質(zhì)粒)分別轉(zhuǎn)染到了 Nthy-ori-3.1細(xì)胞中,構(gòu)建了“LPS + pEX-H19”處理組和“LPS + pEX-2”處理組。本實(shí)驗(yàn)首先利用qRT-PCR確定了 LPS對(duì)1ncRNA-H19的表達(dá)產(chǎn)生的影響,確定了細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,檢測(cè)了不同處理組Nthy-ori-3.1細(xì)胞中的IL-lβ、IL-6和MCP-1在RNA水平上的表達(dá)情況。其次,再次通過(guò)CCK-8計(jì)數(shù)法分別測(cè)定了“對(duì)照組”、“LPS處理組”、“LPS + pEX-2”處理組和“LPS + pEX-H19”處理組Nthy-ori-3.1細(xì)胞的活力。通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染色法搭配流式細(xì)胞儀技術(shù)測(cè)定了各個(gè)處理組份細(xì)胞的凋亡率。以β-actin作內(nèi)參,利用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)了不同處理組Nthy-ori-3.1細(xì)胞中的促調(diào)亡蛋白Bax和Pro/Cleaved-caspase 3、抗凋亡蛋白Bcl-2和炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和MCP-1的蛋白表達(dá)情況,并通過(guò)Image LabTM軟件對(duì)Bax、Bcl-2和Cleaved-caspase 3的蛋白條帶進(jìn)行量化分析。最后利用ELISA試驗(yàn)檢測(cè)了“對(duì)照組”、“LPS處理組”、“LPS + pEX-2”處理組和“LPS + pEX-H19”處理組Nthy-ori-3.1細(xì)胞中IL-1β、IL-6和MCP-1的具體含量。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次,使用 Graphpad統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并計(jì)算尸值,兩個(gè)組份之間的差異性比較用t-test或ANOVA進(jìn)行。第四章過(guò)表達(dá)IncRNA-H19通過(guò)下調(diào)表達(dá)miR-21減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷并抑制JNK和NF-KB信號(hào)通路的活性本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)公司合成了 miR-21 mlimic及其陰性對(duì)照(Negative control,NC)mimic,用以改變細(xì)胞中miR-21的表達(dá)量。通過(guò)lipofectamine 3000試劑盒分別將本次實(shí)驗(yàn)合成的miR-21 mimic與之前合成的IncRNA-H19的過(guò)表達(dá)載體pEX-H19共轉(zhuǎn)染到了Nthy-ori-3.1細(xì)胞中,同時(shí)將NC mimic與pEX-H19也共轉(zhuǎn)染到了 Nthy-ori-3.1細(xì)胞中(作為陰性對(duì)照)。然后對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行LPS誘導(dǎo),構(gòu)建了“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”處理組和“LPS + pEX-H19 +NC mimic”處理組。與之前的實(shí)驗(yàn)相同,通過(guò)CCK-8計(jì)數(shù)法分別檢測(cè)“對(duì)照組”、“LPS處理組”、“LPS + pEX-2 + NC mimic”處理組、“LPS + pEX-H19 +NC mimic”處理組和“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”處理組中Nthy-ori-3.1細(xì)胞的活力。通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染色法搭配流式細(xì)胞儀技術(shù)分別檢測(cè)了各個(gè)處理組當(dāng)中的細(xì)胞的凋亡率。用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)不同處理組細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和Pro/Cleaved-caspase 3、抗凋亡蛋白Bcl-2和炎性細(xì)胞因子IL-lβ、IL-6和MCP-1的蛋白表達(dá)情況。同時(shí)對(duì)細(xì)胞中的核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)通路相關(guān)蛋白和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號(hào)通路相關(guān)蛋白,包括磷酸化的NF-κB抑制蛋白(Inhibitor of NF-κB，，IκB)(Phosphorylated NF-KB,p-IκB)、總體IκB(Total IκB,t-IκB)、磷酸化的p65蛋白(Phosphorylated p65，p-p65)、總體p65蛋白(Total p65，t-p65)、磷酸化的JNK蛋白(Phosphorylated JNK，p-JNK)和總體JNK蛋白(Total JNK,t-JNK的表達(dá)情況進(jìn)行了測(cè)定。β-actin做內(nèi)參。利用Image LabTM軟件對(duì)Bax、Bcl-2和Cleaved-caspase 3 的蛋白條帶以及p-κB與t-IκB 的比值(p/t-IKB)、p-p65與t-p65的比值(p/t-p65)和p-JNK與t-JNK的比值(p/t-JNK)進(jìn)行了量化分析。通過(guò)qRT-PCR方法測(cè)定了“對(duì)照組”、“LPS處理組”、“LPS + pEX-2”處理組和“LPS + pEX-H19”處理組Nthy-ori-3.1細(xì)胞中miR-21在RNA水平上的表達(dá)量;細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)之后,利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-21的相對(duì)含量,確定了轉(zhuǎn)染效率;并檢測(cè)了各處理組細(xì)胞中的IL-1β、IL-6和MCP-1在RNA水平上的表達(dá)量。在對(duì)實(shí)驗(yàn)材料做了相應(yīng)的處理之后,利用ELISA檢測(cè)了“對(duì)照組”、“LPS處理組”、“LPS + pEX-2 + NC mimic”處理組、“LPS + pEX-H19 +NC mimic”處理組和“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”處理組細(xì)胞Nthy-ori-3.1細(xì)胞中的IL-1β、IL-6和MCP-1的具體含量。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次,使用Graphpad統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并計(jì)算尸值,兩個(gè)組份之間的差異性比較用t-test或ANOVA進(jìn)行。研究結(jié)果第二章LPS誘導(dǎo)Nthy-ori-3.1細(xì)胞增殖抑制、凋亡和炎癥因子過(guò)表達(dá)損傷細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與“對(duì)照組”相比,LPS處理使Nthy-ori-3.1細(xì)胞的活力顯著降低(尸0.01);使細(xì)胞凋亡率(尸0.001)和促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase 3的相對(duì)表達(dá)量(二者P0.001)顯著增加,使抗凋亡蛋白Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量(P0.001)顯著降低。炎癥因子表達(dá)結(jié)果表明,相比于“對(duì)照組”LPS處理顯著促進(jìn)了 IL-lβ、IL-6和MCP-1在mRNA水平上的表達(dá)(P0.001,P0.001和尸0.01);使細(xì)胞中的IL-lβ、IL-6和MCP-1的實(shí)際含量明顯增加(所有尸0.001)。說(shuō)明,LPS處理誘導(dǎo)Nthy-ori-3.1細(xì)胞發(fā)生了炎癥損傷。第三章過(guò)表達(dá)IncRNA-H19緩解LPS誘導(dǎo)的Nthy-ori-3.1細(xì)胞增殖抑制、凋亡和炎癥因子過(guò)表達(dá)損傷本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相比于“對(duì)照組”細(xì)胞,“LPS處理組”細(xì)胞中的IncRNA-H19的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(尸0.01)。與“對(duì)照組”相比,“LPS +pEX-2”處理組細(xì)胞中IncRNA-H19的表達(dá)情況未發(fā)生明顯的改變;但相比于“LPS+ pEX-2”處理組,“LPS + pEX-H19”處理組細(xì)胞中IncRNA-H19的表達(dá)量顯增加(尸0.001)。細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明,相比于“對(duì)照組”,“LPS處理組”細(xì)胞的活力顯著降低(尸0.01);與“LPS處理組”相比,“LPS + pEX-2”處理組細(xì)胞的活力沒(méi)有發(fā)生明顯的改變;相比于“LPS + pEX-2”處理組,“LPS +pEX-H19”處理組細(xì)胞的活力顯著上升(尸0.05)。與“對(duì)照組”相比,“LPS處理組”細(xì)胞的凋亡率(P0.001)和Bax以及Cleaved-caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著增高(二者P0.001),Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P0.001);與“LPS處理組”相比,“LPS + pEX-2”處理組細(xì)胞的凋亡率和各物質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生明顯的改變;與“LPS + pEX-2”處理組相比,“LPS + pEX-H19”處理組細(xì)胞的凋亡率(P0.05)以及細(xì)胞中的Bax和Cleaved-caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(二者P0.05),Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量則顯著增加(尸0.01)。檢測(cè)炎癥因子表達(dá)情況的實(shí)驗(yàn)表明,在RNA水平上,相比于“對(duì)照組”，“LPS處理組”細(xì)胞中IL-lβ、IL-6和MCP-1的相對(duì)表達(dá)量均顯著增加(尸0.001，尸0.01和尸0.01);“LPS + pEX-2”處理組和“LPS處理組”的情況基本相同;相比于“LPS + pEX-2”處理組,“LPS + pEX-H19”處理組細(xì)胞中IL-lβ、IL-6和MCP-1的相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(所有P0.05)。在蛋白質(zhì)水平上各個(gè)炎癥因子的表達(dá)情況與在RNA水平上的變化趨勢(shì)相同。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),相比于“對(duì)照組”,LPS處理使細(xì)胞中的IL-1β、IL-6和MCP-1的含量顯著增加(尸0.001，尸0.01和尸0.001);與“LPS處理組”相比,“LPS + pEX-2”處理組細(xì)胞中各個(gè)炎癥因子的含量沒(méi)有發(fā)生明顯的改變;相比于“LPS + pEX-2”處理組，“LPS + pEX-H19”處理組細(xì)胞中IL-lβ、IL-6和MCP-1的含量均顯著降低(所有P0.05)。這些結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)IncRNA-H19能夠緩解LPS對(duì)Nthy-ori-3.1細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥損傷。第四章過(guò)表達(dá)IncRNA-H19通過(guò)下調(diào)表達(dá)miR-21減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷并抑制JNK和NF-κB信號(hào)通路的活性本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與“對(duì)照組”細(xì)胞相比,“LPS處理組”細(xì)胞中的miR-21發(fā)生過(guò)表達(dá),miR-21的表達(dá)量顯著增加(尸0.01);“LPS處理組”與“LPS +pEX-2”處理組之間不存在顯著性差異;與“LPS + pEX-2”處理組相比,“LPS+ pEX-H19”處理組細(xì)胞中,miR-21的表達(dá)量顯著降低(尸0.01)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明,與“對(duì)照組”相比,轉(zhuǎn)染NC mimic沒(méi)有對(duì)miR-21的表達(dá)量產(chǎn)生明顯的影響;相比于轉(zhuǎn)染NC mimic,轉(zhuǎn)染miR-21 mimic使細(xì)胞中miR-21的相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P0.01)。細(xì)胞活力和凋亡試驗(yàn)結(jié)果顯示,與“對(duì)照組”相比,LPS處理使細(xì)胞活力顯著降低(尸0.01);相比于“LPS處理組”,“LPS + pEX-2 + NC mimic”處理組細(xì)胞的活力沒(méi)有發(fā)生明顯的變化;相比于“LPS + pEX-2 + NC mimic”處理組,“LPS + pEX-H19 + NC mimic”處理組細(xì)胞的活力顯著增強(qiáng)(P0.05);與此相比,“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”處理組的細(xì)胞活力明顯降低(尸0.05)。相比“對(duì)照組”,LPS處理使細(xì)胞的凋亡率(尸0.001)以及促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase 3的相對(duì)表達(dá)量顯著增加(二者P0.001),抗凋亡蛋白Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P0.001);與“LPS處理組”與“LPS+ pEX-2 + NC mimic”處理組細(xì)胞之間在凋亡率和各凋亡蛋白的表達(dá)量方面不存在明顯的差別;相比于“LPS + pEX-2 + NC mimic”處理組,“LPS +pEX-H19 + NC mimic”處理組細(xì)胞的凋亡率(尸0.05)以及Bax和Cleaved-caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(二者P0.05),Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著增加(尸0.05);與“LPS + pEX-H19 + NC mimic”處理組相比,“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”處理組細(xì)胞的凋亡率(P0.05)以及Bax和Cleaved-caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)水平明顯升高(二者尸0.05),Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低(尸0.05)。細(xì)胞炎癥因子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與“對(duì)照組”相比,“LPS處理組”細(xì)胞中的IL-1β、IL-6和MCP-1的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P0.001，P0.001和P0.01);與“LPS處理組”相比,“LPS + pEX-2 + NC mimic”處理組細(xì)胞中的炎癥因子的相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化;相比于“LPS +pEX-2 + NC mimic”處理組細(xì)胞,“LPS + pEX-Hl9 + NC mimic”處理組細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(所有尸0.05);相比于“LPS +pEX-H19 + NC mimic”處理組,“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”處理組細(xì)胞中的IL-1β、IL-6和MCP-1的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P0.01，尸0.01和尸0.05)。ELISA的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與“對(duì)照組”相比,“LPS處理組”細(xì)胞中IL-1β、IL-6和MCP-1的含量顯著升高(所有P0.001);與“LPS處理組”與“LPS +pEX-2 + NC mimic”處理組之間不存在明顯差別;相比于“LPS + pEX-2 +NC mimic”處理組,“LPS + pEX-H19 + NC mimic”處理組細(xì)胞中三種炎癥因子的實(shí)際含量均顯著降低(所有尸0.05);與“LPS + pEX-H19 + NC mimic”處理組相比,“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”處理組細(xì)胞中各個(gè)炎癥因子的實(shí)際含量顯著增加(所有尸0.05)。各個(gè)炎癥細(xì)胞因子在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)情況與在RNA水平上一致。信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與“對(duì)照組”相比,“LPS處理組”細(xì)胞中的p-IκB、p-p65和p-JNK蛋白的表達(dá)量以及p/t-IκB、p/t-p65和p/t-JNK明顯增加(所有尸0.001);與“LPS處理組”相比,“LPS + pEX-2 + NC mimic”處理組細(xì)胞中各蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和p/t-IKB、p/t-p65和p-JNK沒(méi)有發(fā)生明顯的改變;與“LPS+ pEX-2 + NC mimic”處理組相比,“LPS + pEX-H19 + NC mimic”處理組細(xì)胞中p-IκB、p-p65和p-JNK蛋白的表達(dá)水平顯著降低,p/t-IKB、p/t-p65和p/t-JNK明顯減小(所有尸0.05);與“LPS + pEX-H19 + NC mimic”處理組相比,“LPS + pEX-H19 + miR-21 mimic”處理組細(xì)胞中 p-IκB、p-p65 和p-JNK蛋白的表達(dá)水平明顯升高,p/t-1lκB、p/t-p65和p/t-JNK顯著增大(所有尸0.05)。此外,所有處理組的細(xì)胞中t-IKB、t-p65和t-JNK蛋白的表達(dá)量均未發(fā)生明顯改變。這些結(jié)果說(shuō)明,過(guò)表達(dá)1ncRNA-H19通過(guò)下調(diào)表達(dá)miR-21減輕了 LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥損傷。結(jié)論:過(guò)表達(dá)1ncRNA-H19通過(guò)下調(diào)表達(dá)miR-21減輕了LPS誘導(dǎo)的Nthy-ori-3.1細(xì)胞增殖抑制、凋亡和炎癥因子過(guò)表達(dá)等炎癥損傷。意義:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探索1ncRNA-H19在LPS誘導(dǎo)的炎癥損傷中的作用和機(jī)制,進(jìn)一步闡明了甲狀腺炎癥損傷的病理學(xué)機(jī)制,為甲減的干預(yù)和治療提供了新的視點(diǎn)。
【圖文】：

通過(guò)ＣＣＫ－８檢測(cè)“對(duì)照組”和“ＬＰＳ處理組”甲狀腺上皮細(xì)胞的活力，我逡逑們得出以下結(jié)果：逡逑如圖１所示，相比于不經(jīng)過(guò)ＬＰＳ處理的細(xì)胞，ＬＰＳ處理１２個(gè)小時(shí)使逡逑Ｎｔｈｙ－ｏｒｉ－３．１細(xì)胞的活力顯著降低（Ｐ＜邋０．０１），這說(shuō)明ＬＰＳ對(duì)細(xì)胞的活力產(chǎn)生了逡逑抑制作用，引發(fā)了X椫騁種菩運(yùn)鶘�。辶x希保擔(dān)埃義希

本文編號(hào)：2670883