【摘要】：第一節(jié)維生素A及維甲酸受體RARs在肛門直腸畸形患兒中的表達(dá)研究目的:檢測(cè)先天性肛門直腸畸形(anorectal malformation,ARM)患兒血清維生素A(vitamin A,VA)水平及腸組織維甲酸受體(retinoic acid receptors,RARs)的表達(dá)特點(diǎn),探究其與ARM患兒腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system,ENS)發(fā)育異常的聯(lián)系。方法:利用高效液相色譜法檢測(cè)32例初診ARM新生兒血清VA濃度,選取30例非消化道畸形新生兒血清作為對(duì)照;收集30例ARM患兒直腸末端及造瘺口橫結(jié)腸組織,選取4例非消化道畸形患兒直腸組織作為對(duì)照,RT-PCR檢測(cè)各組腸組織RARα、RARβ、RARγm RNA表達(dá)水平;根據(jù)患兒直腸末端病檢結(jié)果將ARM患兒直腸組織分為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育正常組和異常組(n=6/組),免疫組織化學(xué)染色和Western blot檢測(cè)兩組直腸RARα蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:ARM新生兒血清VA平均濃度顯著低于對(duì)照組(P0.01);ARM患兒直腸末端RARαm RNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于造瘺口橫結(jié)腸(P0.001)和對(duì)照組直腸(P0.01),而造瘺口橫結(jié)腸與對(duì)照組直腸無(wú)顯著性差異(P0.05);RARβ、RARγm RNA在各組腸組織間相對(duì)表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);RARα蛋白在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核及周圍的神經(jīng)纖維呈陽(yáng)性表達(dá),神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育異常組直腸RARα蛋白表達(dá)水平顯著低于正常組(P0.01)。結(jié)論:ARM患兒存在血清VA及直腸組織RARα表達(dá)異常,VA及其受體RARα可能參與了患兒ENS的發(fā)育過程。第二節(jié)RARα及NeuN在肛門直腸畸形小鼠模型直腸的表達(dá)研究目的:建立全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)誘導(dǎo)的小鼠ARM動(dòng)物模型,篩選最適造模條件;探究ARM小鼠直腸組織RARα和直腸神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN的表達(dá)情況。方法:C57BL/6J孕鼠隨機(jī)分為6組,實(shí)驗(yàn)組B-D:分別于孕7.5、8.5、9.5d(gestation day,GD)予以100mg/kg ATRA灌胃1次,實(shí)驗(yàn)組E-F:分別在GD8.5予以80、60mg/kg ATRA灌胃1次,對(duì)照組A孕鼠在GD8.5予以玉米油灌胃1次,所有孕鼠在GD18.5剖宮取出胎鼠。測(cè)量胎鼠體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng),分別記錄活胎數(shù)和伴隨畸形數(shù)。收集GD16.5-18.5胎鼠直腸組織,RT-PCR和免疫熒光動(dòng)態(tài)檢測(cè)胎鼠直腸RARα、NeuN表達(dá)水平。結(jié)果:各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,活胎體重減輕,身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)縮短(P0.05),C組胎鼠尾長(zhǎng)、身長(zhǎng)顯著小于D組(P0.05),C、E、F組胎鼠體重,身長(zhǎng),尾長(zhǎng)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。GD8.5、9.5予以ATRA灌胃均能誘導(dǎo)ARM畸形;以100mg/kg ATRA處理孕鼠,B組胎鼠全部死亡,C組ARM致畸率和死胎率顯著高于D組(P0.05)。GD8.5予以不同濃度ATRA處理孕鼠,E組ARM致畸率顯著高于F組(P0.05),與C組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);E組死胎率顯著低于C組(P0.05),與F組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。神經(jīng)管畸形(neural tube defects,NTDs)總體發(fā)生率約為10.59%,與C組相比,D、E、F組NTDs發(fā)生率降低(P0.05),而D、E、F組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與同天數(shù)對(duì)照胎鼠相比,GD16.5-18.5ARM胎鼠直腸RARαm RNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P0.05);GD16.5-18.5 ARM胎鼠直腸NeuN m RNA的相對(duì)表達(dá)量也分別低于同天數(shù)對(duì)照胎鼠直腸(P0.05)。GD16.5-18.5胎鼠直腸均有RARα和NeuN蛋白的陽(yáng)性表達(dá);RARα陽(yáng)性染色主要集中在腸肌層區(qū)域,和神經(jīng)元細(xì)胞核標(biāo)記物NeuN的表達(dá)部位有重疊;與同天數(shù)對(duì)照胎鼠直腸相比,ARM胎鼠直腸RARα和NeuN的熒光強(qiáng)度均降低結(jié)論:成功建立了ATRA誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠ARM動(dòng)物模型,GD8.5 80mg/kg劑量ATRA灌胃1次為適宜造模條件,致畸率可達(dá)95.2%。在ARM模型小鼠中,GD16.5-18.5胎鼠直腸神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN和RARα表達(dá)水平降低,且兩者表達(dá)部位有重疊,過量的ATRA可能誘導(dǎo)機(jī)體負(fù)反饋調(diào)節(jié)導(dǎo)致腸組織RARα水平下調(diào),從而影響ARM小鼠ENS發(fā)育的過程。
【圖文】：

****：P＜0.0001圖 2.1ARM 新生兒和對(duì)照新生兒血清 VA 濃度Fig.2.1 Serum VAlevels in control and ARM neonates RARs mRNA 水平

不同組腸組織RARαmRNA相對(duì)表達(dá)量
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R726.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2662357