【摘要】：第一章廣西新增的三例兒童早老癥患兒的臨床特征及致病基因分析目的:分析廣西地區(qū)新增的兩個兒童早老癥家系3例兒童早老癥患兒的臨床特點,通過基因檢測尋找突變位點,初步探索兒童早老癥基因型與臨床表型的關聯(lián)性。方法:收集并分析廣西地區(qū)新增的兩個家系3例兒童早老癥患兒的臨床資料。對其中2例就診的兒童早老癥患兒進行皮膚活檢病理檢查。同時提取兩個家系2代共9名成員的外周血DNA,對其LMNA基因12對外顯子進行測序,尋找遺傳學病因,分析基因型與臨床表型的關聯(lián)性。結果:3例患兒均具備典型的兒童早老癥表型,包括身材矮小、皮膚硬化、皮下脂肪萎縮、骨質溶解、衰老面容、脫發(fā)等;除此,所有患兒均表現(xiàn)出近端指指關節(jié)固定屈曲畸形伴有遠端指節(jié)的吸收變短。3例患兒的疾病發(fā)展模式相似,均在一歲之前出現(xiàn)癥狀且均以皮膚異常為首發(fā)癥狀,包括皮膚瘙癢、色素異常和(或)毛發(fā)脫落,癥狀隨年齡增長逐漸加重。3例患兒均有血小板升高、血肌酐降低。皮膚病理均提示為硬皮病樣改變�；驕y序結果提示兩個家系的3例患者均為1號染色體上的LMNA基因第9號外顯子發(fā)生c.1579CT(p.R527C)純合突變,其表型正常的同胞及父母為致病基因攜帶者。結論:廣西地區(qū)新增的兩個兒童早老癥家系3例患兒均為LMNA基因R527C純合突變兒童早老癥患兒。LMNA基因R527C純合突變兒童早老癥的臨床表型與其基因型存在相關性。第二章廣西三個LMNA基因R527C純合突變兒童早老癥家系致病基因所在染色體的單倍型分析目的:將廣西地區(qū)發(fā)現(xiàn)的三個LMNA基因R527C純合突變兒童早老癥家系兩代(父母及子女)全部成員的遺傳標記分型結果構建成單倍型進行分析,揭示三個家系致病基因是否來源于奠定者效應。方法:收集廣西地區(qū)發(fā)現(xiàn)的三個LMNA基因R527C純合突變兒童早老癥家系(本文研究發(fā)現(xiàn)的兩個家系以及前期研究發(fā)現(xiàn)的另外一個家系)兩代成員(患兒及父母)外周血,提取全基因組DNA,應用聚合酶鏈式反應(PCR)及毛細管電泳技術檢測LMNA基因附近的微衛(wèi)星位點(D1S498、D1S2714、D1S2721、D1Z10),將結果整理為單倍型進行分析。結果:三個家系R527C突變LMNA基因所在的染色體的微衛(wèi)星標記D1S2721和D1Z10組合一致,大小均分別為243bp和115bp,正常未突變LMNA基因所在的染色體的微衛(wèi)星標記D1S2721和D1Z10具有4種不同組合,且與致病基因所在染色體的組合不一致。結論:廣西地區(qū)發(fā)現(xiàn)的三個LMNA基因R527C純合突變兒童早老癥家系的1號染色體致病基因附近區(qū)域具有唯一一種特定單倍型,提示該三個家系致病基因的來源可能具有奠定者效應而并非人群中獨立散發(fā)隨機突變引起。第三章LMNA基因R527C純合突變兒童早老癥患兒外周血來源IPS-MSCs的構建及生物學特性研究目的:通過對LMNA基因R527C純合突變兒童早老癥患兒及健康對照者的外周血獲得的誘導性多能干細胞來源的間充質干細胞(IPS-MSCs)細胞系的構建及生物學特性研究,探索LMNA基因R527C純合突變對IPSMSCs的影響,為后續(xù)研究奠定基礎。方法:將LMNA基因R527C純合突變兒童早老癥患兒(R527C組)及健康對照者(Control組)獲得的外周血血細胞重新編程為IPS細胞,使用人類多能干細胞來源間充質干細胞分化試劑盒進一步分化為MSCs。通過流式細胞術檢測MSCs細胞免疫表型CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD14、CD79a、HLA-DR。提取MSCs細胞DNA進行LMNA基因測序。使用成脂分化試劑盒及成骨分化試劑盒對MSCs進行成脂分化和成骨分化,并使用油紅o染液及茜素紅染液進行染色鑒定細胞分化潛能。通過LaminA和LaminB細胞免疫熒光檢測MSCs細胞核形態(tài)。通過CCK-8法檢測MSCs的增殖情況。流式細胞術檢測MSCs的凋亡情況。使用SA-β-gal染色試劑盒檢測MSCs細胞的衰老情況。Western Blot檢測p21及γ-H2AX蛋白的表達情況。RT-qPCR檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23、TNF-α的mRNA表達水平及衰老相關蛋白p16、p21、p53的mRNA表達水平。結果:兩組外周血來源IPS-MSCs細胞表面均高表達CD73、CD90和CD105,CD34、CD45、CD14、CD79a、HLA-DR均表達陰性。LMNA基因測序顯示R527C組外周血來源IPS-MSCs存在LMNA基因R527C純合突變,而Control組的LMNA基因無變異。成脂及成骨分化及染色鑒定顯示兩組外周血來源的IPS-MSCs均具有分化潛能。免疫熒光顯示兩組IPSMSCs均表達LaminA和LaminB蛋白,且R527C組細胞核明顯彎曲、變形。R527C組外周血來源IPS-MSCs增殖緩慢,增值率從第2天開始較健康對照組明顯下降(p0.05);細胞凋亡增加,早期凋亡及晚期凋亡比例均增加,以早期凋亡更為顯著(p0.05);SA-β-gal染色顯示衰老細胞陽性率升高;IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23炎癥因子及衰老標志物p16、p21的mRNA水平表達增加(p0.05);wb顯示p21蛋白表達增加(p0.05),但DNA損傷標志物γ-H2AX表達無差異(p0.05)。結論:我們成功構建了LMNA基因R527C純合突變兒童早老癥外周血來源IPS-MSCs模型,并發(fā)現(xiàn)其生物學特性與健康對照組存在明顯差異,為進一步的機制探索及干預研究奠定了基礎。
【圖文】：

圖 1-1 早老癥患兒的臨床表型 （A-D 為病例 1；E-H 為病例 2；I-K 為病例 3）；A、E：身材矮小、騎馬樣站姿；B、F、I：禿發(fā)、眉毛缺失、小下頜、尖鼻等早老面容；C、G、J：患兒雙手近端指指關節(jié)嚴重屈曲畸形，指節(jié)吸收、變短、缺如，手背皮膚硬化、色素加深；D、H、K：雙下皮膚硬化、色素加深、皮下脂肪萎縮、散在潰瘍，膝關節(jié)屈曲固定。Fig1-1 The clinical phenotype of the patients with progeria syndrome圖 1-2 早老癥患兒影像學特點（病例 1 患兒） A：梨形胸、鎖骨發(fā)育不全或溶解；B-D：四肢密度減少、部分骨質缺損。Fig 1-2 The X-ray of the patientwith progeria syndrome依據(jù) 2009 年首都兒科研究所生長發(fā)育研究室制作的兒童青少年身高

圖 1-1 早老癥患兒的臨床表型 （A-D 為病例 1；E-H 為病例 2；I-K 為病例 3）；A、E：身材矮小、騎馬樣站姿；B、F、I：禿發(fā)、眉毛缺失、小下頜、尖鼻等早老面容；C、G、J：患兒雙手近端指指關節(jié)嚴重屈曲畸形，指節(jié)吸收、變短、缺如，，手背皮膚硬化、色素加深；D、H、K：雙下肢皮膚硬化、色素加深、皮下脂肪萎縮、散在潰瘍，膝關節(jié)屈曲固定。Fig1-1 The clinical phenotype of the patients with progeria syndrome
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R725.9

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3 胡建妙,張艷爾;兒童早老癥1例報告[J];實用放射學雜志;1993年11期

4 ;導致早老癥的基因變異[J];中國科技信息;2003年09期

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本文編號：2653772