【摘要】：研究背景先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung disease,HSCR)又稱腸無神經(jīng)節(jié)細胞癥,是一類與腸神經(jīng)嵴細胞發(fā)育異常相關(guān)性疾病,其病理特點為病變腸段粘膜下及肌間神經(jīng)叢神經(jīng)節(jié)細胞缺如。神經(jīng)節(jié)細胞缺如是由于腸神經(jīng)嵴細胞(Enteric neural crest cells,ENCCs)增殖、遷移、分化和定植出現(xiàn)障礙,從而導致腸神經(jīng)系統(tǒng)(Enteric nervous system,ENS)發(fā)育異常,引起胃腸道調(diào)控功能失衡并帶來一系列的臨床問題。要研究腸神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育過程,就必須運用合適的腸神經(jīng)發(fā)育來源的細胞模型,但目前缺乏更合適的工具細胞來研究腸神經(jīng)系統(tǒng)的形成過程。MicroRNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物體內(nèi)的小RNA分子,長度約為21-25個核苷酸。miRNA主要通過與目的基因mRNA3'非編碼區(qū)以不完全堿基配對結(jié)合方式降低mRNA穩(wěn)定性或抑制目的基因的翻譯。而miRNA的異常表達靶向調(diào)控目的基因從而影響先天性巨結(jié)腸及腸神經(jīng)系統(tǒng)的形成。前期通過miRNA基因芯片檢測先天性巨結(jié)腸表達譜發(fā)現(xiàn),多種miRNA明顯上調(diào),而miR-145-3p先天性巨結(jié)腸狹窄段中的表達量明顯高于擴張段3倍以上。目前,也有不少研究關(guān)于miRNA與先天性巨結(jié)腸的研究,但大部分研究所用工具細胞為神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y及293T細胞系。因為腸神經(jīng)嵴細胞提取鑒定困難,難以完成后續(xù)的功能實驗。所有,選擇適合的工具細胞研究先天性巨結(jié)腸及腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育是非常有必要的。本研究通過提取來源于SD大鼠的腸神經(jīng)干細胞(Enteric neural stem cells,ENSCs)分析其生物學特性,通過構(gòu)建LV-miR-145-3p基因過表達慢病毒載體,感染體外培養(yǎng)的腸神經(jīng)干細胞,進而探究miR-145-3p對腸神經(jīng)干細胞增殖分化的影響,尋找到最佳的轉(zhuǎn)染方式,為先天性巨結(jié)腸等腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常性疾病提供了合適的工具細胞。研究目的1.探究SD大鼠腸神經(jīng)干細胞原代培養(yǎng)及鑒定;2.探究不同轉(zhuǎn)染方式對轉(zhuǎn)染腸神經(jīng)干細胞的作用效果;3.探究過表達miR-145-3p對腸神經(jīng)干細胞增殖分化的作用。研究方法1.通過原代培養(yǎng)提取不同孕齡SD大鼠腸神經(jīng)干細胞,比較其神經(jīng)球生長情況,并行Nestin及GFAP鑒定其為神經(jīng)干細胞。2.細胞分為過表達組、陰性對照組及空白對照組,分別運用脂質(zhì)體及慢病毒載體對腸神經(jīng)干細胞進行miR-145-3p過表達轉(zhuǎn)染,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果,并運用RT-qPCR進行miR-145-3p過表達驗證。3.運用Edu細胞增殖實驗,熒光鑒定各組細胞增殖情況,記錄各組Edu/DAPI陽性的比例。用神經(jīng)干細胞分化培養(yǎng)基使各組神經(jīng)球分化,記錄分化后細胞GFAP/DAPI 比例。研究結(jié)果1.成功提取孕18天SD大鼠胎鼠腸管細胞,免疫熒光結(jié)果顯示原代培養(yǎng)細胞細胞Nestin和GFAP陽性,證明所提取的細胞為腸神經(jīng)干細胞。2.miR-145-3p過表達慢病毒成功感染神經(jīng)球后,細胞生長良好,95%以上細胞能均勻表達GFP綠色熒光,且實時熒光PCR結(jié)果顯示,miR-145-3p過表達組的相對表達量是對照組的275.85倍,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),證明慢病毒成功轉(zhuǎn)染腸神經(jīng)干細胞。3.Edu細胞滲入實驗結(jié)果顯示,與過表達對照組相比較,miR-145-3p過表達組EdU陽性率為15.23±1.17%,NC對照組EdU陽性率為22.38±1.52%,過表達組較NC對照組顯著下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在分化培養(yǎng)基中處理之后miR-145-3p過表達組GFAP陽性細胞比例為21.47±1.98%,NC對照組為33.86±2.52%,過表達組分化細胞數(shù)目較對照組明顯減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),過表達miR-145-3p可抑制腸神經(jīng)干細胞的增殖分化。
【圖文】：

圖１－１神經(jīng)干細胞形態(tài)學結(jié)果（倒置顯微鏡ｘｌＯＯ）逡逑Ｆｉｇｌ－１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＥＮＳＣｓ邋（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋ｘ邋１００）逡逑１．３．２腸神經(jīng)干細胞鑒定逡逑在培養(yǎng)生長良好的神經(jīng)球，，運用免疫熒光對懸浮神經(jīng)球作Ｎｅｓｔｉｎ鑒定及分逡逑化后ＧＦＡＰ鑒定。結(jié)果顯示有９５％以上的細胞顯示Ｎｅｓｔｉｎ陽性表達及分化后逡逑９逡逑

第二章ｍｉＲ－１４５－３ｐ對腸神經(jīng)干細胞增殖與分化的影響逡逑ＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＴＡＡＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＴＧＴＡＡＧＴＣＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＡＡ逡逑ＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＣＣＧＡＣＴＣＧＴＣＴＧＡＧＧＧ逡逑ＣＧＡＡＧＧＣＧＧＡＧＡＣＧＣＧＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＣＡＧＡＧＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧ逡逑ＧＡＡＧＧＡＡＧＧＴＣＣＧＣＴＧＧＡＴＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＡＧＧＧＡＣＧＴＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＧ逡逑ＴＣＣＣＧＣＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡＣＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＡＧＧＡ逡逑ＣＧＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＡＣＧＧＡＡＴＴＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＡＡＣＡＧＣＣＧＡＧ逡逑ＣＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＧＣＡＡＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＧＣＣＧＴＧＣＡＡ逡逑ＴＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＴＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣ逡逑ＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＧ．逡逑■邐３：Ｃ邐Ｊ；０邐３３：邐３？０逡逑：邐：邋ｉ邋Ａ邋Ｓ邋＇邐５邋Ｇ邋：逡逑
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R725.7

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本文編號：2650759