【摘要】：前言 先天性肥厚性幽門狹窄(congenital hypertrophic pyloric stenosis, CHPS)是新生兒常見的消化道先天性畸形,其發(fā)病率具有種族、性別和地區(qū)差異,男性較多,占90%以上。多合并有其他先天性疾病。主要臨床癥狀為出生后15～25天,于進食后10～30 min出現(xiàn)頻繁嘔吐胃內(nèi)容物,無膽汁;體檢于中上腹部可捫及橄欖樣包塊。主要原因在于幽門部肌肉肥厚所致的幽門管腔狹窄及胃出口的梗阻。目前病因及發(fā)病機理不清,研究表明其發(fā)病與遺傳及環(huán)境因素有關。先后有學者認為染色體16p12-p13位點、一氧化氮合酶(NOS1)基因、胃動素基因與其發(fā)病相關,但未獲更多證據(jù)支持。最近國外學者通過全基因組掃描分析,認為瞬時受體電位離子通道蛋白6(transient receptor potential channel 6, TRPC6)可能為CHPS的易感基因。 以上研究基本是針對國外人群進行的,尚無我國的相關深入研究。故本研究先通過對307例住院CHPS患者進行臨床數(shù)據(jù)的回顧性分析,研究其臨床發(fā)病特點;然后選擇19個核心家系(患者和父母雙親),進行全基因組芯片掃描,初步探索其發(fā)病相關基因位點;再擴大樣本,采用測序的方法進行基因分型,針對初步確定的候選基因位點(TMX基因的多態(tài)性位點rs7161242及rs7160810)進行無關個體的病例-對照分析及核心家系的傳遞不平衡檢驗(Transmission/Disequilibrium Test,TDT),進一步驗證其與CHPS的關系,并利用生物信息學方法,研究多態(tài)性位點的不同基因型對基因的結(jié)構及功能的影響;最后采用免疫組化方法,研究多態(tài)性位點所在的TMX基因在CHPS患者幽門平滑肌組織中的表達。 第一部分中國漢族人群先天性肥厚性幽門狹窄臨床特征 目的:探討中國漢族人群先天性肥厚性幽門狹窄(CHPS)的臨床發(fā)病特點,為診斷、治療,以及遺傳易感基因研究和流行病學調(diào)查提供依據(jù)。 方法:對307例CHPS住院患兒的病歷資料進行回顧性總結(jié)和分析,觀察項目包括患兒性別、發(fā)病年齡、體重變化、入院時電解質(zhì)及動脈血氣情況、B超檢查結(jié)果及合并其他先天性疾病情況。將發(fā)病10天內(nèi)治療者列為早期組,而超過10天者列為晚期組,比較這兩組動脈血氣、電解質(zhì)及日平均體重增加的差別。 結(jié)果:307例患兒中男性262例,女性45例,發(fā)病年齡1~351天,去掉離散程度較大者6例,其余301例平均發(fā)病年齡23.8±13.0天。患兒出生體重1.6~4.5kg,平均3.24±0.44kg;只有1對同卵雙胞胎同時患病;合并其它先天性疾病共62例(20.2%),前二位的是心血管和消化系統(tǒng)的先天性異常。幽門環(huán)肌B超厚度3~8mm,平均5.4±1.1mm。早期組日平均體重增加明顯大于晚期組,而低鉀血癥、低氯血癥及高碳酸血癥發(fā)生率明顯低于晚期組(P0.05);血鈉與血pH值無顯著性差異。 結(jié)論:中國漢族人群CHPS以男性為主,發(fā)病年齡為3~5周,幽門環(huán)肌厚度5.4±1.1mm,合并其它先天性疾病比例較高,但家庭聚集發(fā)病少見。對于在出生后3~5周內(nèi)出現(xiàn)持續(xù)性嘔吐患兒,應高度警惕CHPS,并應盡快診治,以減少低氯低鉀性堿中毒的發(fā)生,避免病情進一步惡化。 第二部分CHPS核心家系的全基因組芯片掃描分析 目的:從全基因組范圍內(nèi)探索CHPS發(fā)病相關基因。 方法:對由19個患兒及父母組成的核心家系,采用Affymetrix公司的SNP 6.0基因芯片進行全基因組芯片掃描,并用golden helix 6.4軟件包的FBAT模塊進行分析,搜索與CHPS發(fā)病相關的基因及位點,對所發(fā)現(xiàn)的有顯著性意義的位點,進一步根據(jù)基因的功能及P值,選擇候選基因。 結(jié)果:以p值達10-5為判定標準,總共發(fā)現(xiàn)105個SNP位點,通過初步篩選,發(fā)現(xiàn)位于硫氧還蛋白相關跨膜蛋白1基因(thioredoxin-related transmembrane protein 1,TMX)上的多態(tài)性位點rs7161242與中國漢族人群CHPS發(fā)病相關聯(lián)。 結(jié)論:TMX基因的rs7161242位點與中國漢族人群CHPS發(fā)病相關聯(lián)。 第三部分TMX基因與先天性肥厚性幽門狹窄遺傳易感性的關聯(lián)研究 目的:探索TMX多態(tài)性位點rs7161242[c.492TG]及rs7160810[c.648GA]與CHPS發(fā)病的相關性。方法:應用PCR及測序的方法,對多態(tài)性位點rs7161242及rs7160810進行基因分型,對22個核心家系進行TDT分析,進一步對31例CHPS患兒與60名正常對照采用病例-對照研究,來探索這兩個SNP位點與CHPS發(fā)病的相關性,并利用在線軟件對這兩個SNP位點進行生物信息分析,研究其多態(tài)性與TMX基因結(jié)構與功能之間的關系,進一步利用免疫組化方法來研究TMX基因表達與CHPS發(fā)病的關系。 結(jié)果:測序結(jié)果驗證了芯片掃描的準確性,未發(fā)現(xiàn)新的突變位點;患兒、父母及正常對照者組內(nèi)這兩個多態(tài)性位點的Hardy-Weinberg平衡檢驗均P0.05,TDT檢驗提示多態(tài)性位點rs7161242的G等位基因及rs7160810的A等位基因的均與CHPS發(fā)病相關,其P值分別為2.0×10-4和5.699×10-5;連鎖不平衡分析結(jié)果提示:這兩個位點的r2為0.757,D'值為0.893,成緊密連鎖。病例-對照研究提示rs7160810位點A等位基因純合子患病風險明顯增加(OR=3.932,95%CI:1.545~10.006, x 2 =8.924,P=0.012);rs7161242位點G等位基因純合子患病風險明顯增加(OR=4.222,95%CI:1.655~10.772, x 2=9.630,P=0.002)。在線分析發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點rs7161242位于第6外顯子剪接受點(acceptor site)區(qū)域內(nèi),會導致熵值和自由能的改變。rs7161242位點的TT基因型的最大熵低于GG基因型(-19.55 VS -22.22),所轉(zhuǎn)錄的RNA的二級結(jié)構的自由能也低于GG基因型;rs7160810位點GG基因型的最大熵也低于AA基因型,所轉(zhuǎn)錄的RNA的二級結(jié)構的自由能也低于AA基因型,提示rs7161242位點的GG基因型及rs7160810位點的AA基因型相對不穩(wěn)定,且其轉(zhuǎn)錄的mRNA也相對不穩(wěn)定。免疫組化結(jié)果提示TMX基因在幽門平滑肌細胞膜和細胞漿表達,未發(fā)現(xiàn)在細胞核中表達。采用Image-Pro Plus 6.0(IPP)圖像分析系統(tǒng)測量陽性細胞平均光密度值(IOD mean,MOD),半定量分析發(fā)現(xiàn)TMX基因在CHPS患兒幽門部平滑肌的表達量明顯弱于正常對照者(0.117±0.033 VS 0.229±0.044,P0.001)。 結(jié)論: 1、TMX基因的多態(tài)性位點rs7161242[c.492TG]及rs7160810[c.648GA]與中國漢族人群CHPS發(fā)病密切相關。rs7161242位點GG基因型及rs7160810位點AA基因型是CHPS患病的危險因素。 2、TMX基因的兩個多態(tài)性位點rs7161242[c.492TG]及rs7160810[c.648GA]會影響RNA的二級結(jié)構。 3、TMX基因在平滑肌細胞膜及細胞漿中表達,未發(fā)現(xiàn)在細胞核中表達。 4、TMX基因在CHPS患兒的幽門環(huán)形肌中表達顯著低于正常對照。
【圖文】：

患兒發(fā)病時間正態(tài)性檢驗

B超測定患兒幽門環(huán)形肌厚度的正態(tài)性檢驗
【學位授予單位】：廣州醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R722.1

【參考文獻】

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