【摘要】：目的:發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良(developmental dysplasia of the hip,DDH)是造成兒童殘疾和早期骨關(guān)節(jié)炎的主要原因之一。在我國(guó),每1000個(gè)孩子中約有1.1~3.8名DDH患兒,危險(xiǎn)因素包括臀位產(chǎn),初產(chǎn),羊水過少,高出生體重,直腿襁褓,女性及家族史等。DDH作為一種復(fù)雜的多基因病,具體病因不明,是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,其中遺傳因素起著重要作用。前期,我們通過DDH家系的SNP芯片全基因組掃描分析研究,證實(shí)妊娠相關(guān)血漿蛋白-A2(pregnancy-associated plasma protein-A2,PAPP-A2)基因與DDH的發(fā)生相關(guān)。PAPPA2基因位于1號(hào)染色體的q24區(qū)域,包括23個(gè)外顯子和22個(gè)內(nèi)含子。而PAPP-A2蛋白作為一種金屬蛋白酶,能夠特異性的水解胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-5(insulin-like growth factor-binding protein-5,IGFBP-5)。它是胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白家族成員之一,是6個(gè)家族成員中在骨骼中含量最豐富的一個(gè)。IGFBP-5能夠和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)結(jié)合,形成IGF-I-IGFBP-5復(fù)合體,導(dǎo)致組織內(nèi)游離的IGF1減少,從而降低IGF1的生物利用度。IGF作為與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的重要因子,調(diào)節(jié)著軟骨的發(fā)育及成纖維細(xì)胞合成膠原成份。而髖臼軟骨發(fā)育不良和髖關(guān)節(jié)周圍軟組織松弛又是DDH發(fā)生的兩大主要病理因素。因此,本研究旨在通過體外細(xì)胞及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探明Pappa2基因如何通過IGF信號(hào)通路影響軟骨組織及纖維組織的發(fā)育,進(jìn)而導(dǎo)致DDH易感。我們首先進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),通過上調(diào)或下調(diào)PAPP-A2蛋白的含量,來觀察小鼠成纖維細(xì)胞系及原代軟骨細(xì)胞中IGF1及膠原合成,軟骨增殖的變化。同時(shí)也進(jìn)行了動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),通過局部轉(zhuǎn)染及羊膜腔注射轉(zhuǎn)染PAPP-A2 sgRNA慢病毒來干擾Pappa2基因的表達(dá),從而比較兩組間小鼠髖關(guān)節(jié)發(fā)育和IGF信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的差異。方法:本研究分為兩個(gè)部分。1、PAPP-A2異常表達(dá)對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞系膠原合成及小鼠原代軟骨細(xì)胞增殖的影響成纖維細(xì)胞系在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合后分別以(1)IGFBP-5蛋白,(2)PAPP-A2蛋白,(3)空白對(duì)照,(4)PAPP-A2 sgRNA慢病毒,(5)對(duì)照組慢病毒進(jìn)行干預(yù)。按濃度梯度進(jìn)行PAPP-A2蛋白、IGFBP-5蛋白干擾,同時(shí)進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn),采用羥脯氨酸堿水解法測(cè)定各組成纖維細(xì)胞的膠原合成情況。確定最佳濃度后通過Western blot,Real time RT-PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原COL1A1及IGF1蛋白、mRNA的表達(dá)情況。原代軟骨細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合后分別以(1)IGFBP-5蛋白,(2)PAPP-A2蛋白,(3)空白對(duì)照,(4)PAPP-A2 sgRNA慢病毒,(5)對(duì)照組慢病毒進(jìn)行干預(yù)。通過Western blot,Real time RT-PCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞ACAN、Ⅱ型膠原COL2及IGF1蛋白,mRNA的表達(dá)情況。2、Pappa2基因低表達(dá)對(duì)小鼠髖臼、股骨頭軟骨增殖,髖臼周圍軟組織膠原合成及對(duì)小鼠髖關(guān)節(jié)形態(tài)的的影響PAPP-A2 sgRNA慢病毒及對(duì)照組慢病毒通過體表大轉(zhuǎn)子定位,經(jīng)胰島素針分別注射到生后四天的雌性ICR小鼠(B4)右側(cè)及左側(cè)髖關(guān)節(jié)周圍,在小鼠生后14天時(shí)(B14)處死取材,經(jīng)過體式熒光顯微鏡觀察熒光后,制作石蠟切片,提取RNA、蛋白觀察IGF,COL1A1、COL2、ACAN、IGFBP-5、PAPP-A2的表達(dá)情況。PAPP-A2 sgRNA慢病毒經(jīng)羊膜腔顯微注射到孕13天(P13)小鼠子宮內(nèi)。在胎鼠出生前一天(P19)處死孕鼠,獲取慢病毒干擾的胎鼠。通過免疫熒光檢測(cè)IGF、COL1A1、COL2、ACAN、PAPP-A2的表達(dá)情況。PAPP-A2 sgRNA慢病毒及對(duì)照組慢病毒通過體表大轉(zhuǎn)子定位,經(jīng)胰島素針分別注射到生后4天的雌性ICR小鼠(B4)雙側(cè)髖關(guān)節(jié)周圍,在小鼠生后14天時(shí)(B14)處死取材,觀察大體組織形態(tài)變化,測(cè)量髖臼橫徑,經(jīng)過體式熒光顯微鏡觀察熒光后,制作石蠟切片,番紅固綠染色觀察軟骨各層細(xì)胞(靜止細(xì)胞層、增殖細(xì)胞層及肥大細(xì)胞層)及骨化情況。結(jié)果:1、在成纖維細(xì)胞中,隨著添加的PAPP-A2蛋白濃度的增加,經(jīng)平臺(tái)期后,成纖維細(xì)胞膠原蛋白的表達(dá)上調(diào)。而添加IGFBP-5蛋白,成纖維細(xì)胞膠原蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組降低。2、添加PAPP-A2蛋白干擾的成纖維細(xì)胞羥脯氨酸含量增加,IGF1表達(dá)上調(diào);添加IGFBP5蛋白干擾的成纖維細(xì)胞IGF1,COL1A1表達(dá)下調(diào)。3、PAPP-A2 sgRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞較對(duì)照組羥脯氨酸含量降低,IGF1、PAPP-A2表達(dá)下調(diào),IGFBP5表達(dá)上調(diào)。4、添加PAPP-A2蛋白干擾的原代軟骨細(xì)胞ACAN表達(dá)上調(diào),而添加IGFBP5蛋白干擾的原代軟骨細(xì)胞ACAN、COL2表達(dá)下調(diào)。5、PAPP-A2 sgRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的原代軟骨細(xì)胞與對(duì)照組相比PAPP-A2、ACAN、IGF1表達(dá)下調(diào),IGFBP5表達(dá)上調(diào)。6、通過髖關(guān)節(jié)局部注射PAPP-A2 sgRNA慢病毒的小鼠,在B14天時(shí)髖臼及股骨頭軟骨PAPP-A2、ACAN、COL2表達(dá)下調(diào),IGFBP5表達(dá)上調(diào)。髖臼周圍軟組織IGF1表達(dá)下調(diào)。7、PAPP-A2 sgRNA慢病毒羊膜腔顯微注射的小鼠,在P19天時(shí)小鼠髖臼股骨頭軟骨PAPP-A2、IGF1、ACAN、COL2表達(dá)下調(diào),髖臼周圍軟組織PAPP-A2、IGF1、COL1A1表達(dá)下調(diào)。8、通過髖關(guān)節(jié)局部注射PAPP-A2 sgRNA慢病毒的小鼠,在B14天時(shí)髖臼橫徑增大,髖臼窩變淺,軟骨細(xì)胞排列疏松,肥大細(xì)胞減少。結(jié)論:1、在成纖維細(xì)胞中,PAPP-A2蛋白干擾可上調(diào)成纖維細(xì)胞膠原的表達(dá),并且呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。IGFBP-5蛋白干擾可下調(diào)成纖維細(xì)胞膠原的表達(dá)。2、Pappa2表達(dá)在成纖維細(xì)胞系及原代軟骨細(xì)胞中與IGFBP-5表達(dá)負(fù)相關(guān),IGFBP-5高表達(dá)可降低IGF1的表達(dá)。3、在小鼠髖臼周圍軟組織中Pappa2可通過影響IGFBP-5的表達(dá)間接影響IGF1的表達(dá)。4、在小鼠髖臼及股骨頭軟骨中,低表達(dá)的Pappa2可通過影響IGFBP-5的表達(dá)間接影響軟骨的生長(zhǎng)。5、Pappa2低表達(dá)可一定程度上影響小鼠髖臼形態(tài)。
【圖文】：

相較于空白對(duì)照組，，明顯增加成纖維細(xì)胞膠原蛋白的表達(dá)。而培養(yǎng)細(xì)胞用IGFBP-5 蛋白處理后，膠原蛋白的表達(dá)量較空白對(duì)照降低，但未發(fā)現(xiàn)與加入IGFBP-5 蛋白的濃度呈相關(guān)性。當(dāng) PAPP-A2 蛋白加入量 8 微克（表 4，圖 1），IGFBP-5 蛋白加入量為 5 微克（表 5，圖 2）時(shí)，羥脯氨酸含量變化有意義。表 4 PAPP-A2 處理對(duì)成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)的影響PAPP-A2(μg) EXP(μg/ml) CONT(μg/ml) EXP/CONT0.352 0.8886 1.4486 0.60.88 2.1510 2.0999 1.02431.32 2.2221 2.1862 1.01641.76 2.1208 2.1862 0.97014.4 2.2611 2.6058 0.86776.6 0.2479 0.1700 1.45878.8 0.326474 0.237523 1.374494注：所用 PAPP-A2 濃度為 0.44μg/μl。EXP：為不同容量 PAPP-A2 處理后的膠原蛋白實(shí)際表達(dá)量；CONT：為相應(yīng) PAPP-A2 處理組對(duì)照樣本的膠原蛋白實(shí)際表達(dá)量。

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文表 5 IGFBP-5 處理對(duì)成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)的影響IGFBP-5(μg) EXP(μg/ml) CONT(μg/ml) EXP/CONT2.0 1.0260470.9982711.0278242.5 1.65832.09990.78975 1.84432.09990.87838 2.1159 2.3581 0.897310 2.0824 2.6058 0.7991注：所用 IGFBP-5 濃度為 1μg/μl。EXP：為不同容量 IGFBP-5 處理后的膠原蛋白實(shí)際表達(dá)量；CONT：為相應(yīng) IGFBP-5 處理組對(duì)照樣本的膠原蛋白實(shí)際表達(dá)量。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R726.8

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本文編號(hào)：2646098