【摘要】： 目的：研究重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin, rhEPO)對(duì)新生兒窒息后血清誘導(dǎo)人近曲腎小管上皮細(xì)胞(human renal proximal tublar cells, HK-2)損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法：(1)以人人近曲腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)為研究對(duì)象。(2)以新生兒重度窒息(Apgar評(píng)分小于4分)后24h血清(20%體積分?jǐn)?shù))作為攻擊因素。(3)先將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和窒息組,探討窒息后血清誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的損傷是否有線(xiàn)粒體形態(tài)變化。再將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、窒息組和rhEPO組,探討rhEPO對(duì)窒息后血清導(dǎo)致HK-2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。(4)檢測(cè)指標(biāo)：倒置相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,Cell Counting Kit-8 (CCK-8)法檢測(cè)細(xì)胞活力變化,免疫組織化學(xué)法觀(guān)察與線(xiàn)粒體形態(tài)變化相關(guān)的蛋白：動(dòng)力相關(guān)蛋白1 (Dynamin related protein 1, DRP1)和視神經(jīng)萎縮癥蛋白(optic atrophy, OPA1)的表達(dá),透射電子顯微鏡觀(guān)察線(xiàn)粒體形態(tài)變化。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,分別進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)和單因素方差分析組間LSD檢驗(yàn),采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。P0.05為差異有顯著性。 結(jié)果：(1)倒置相差顯微鏡下觀(guān)察HK-2形態(tài)學(xué)變化：對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好,透明度大,折光性強(qiáng),呈鋪路石樣,為扁平的多角形,分裂相多,細(xì)胞排列緊密,連接成片,數(shù)量多,胞質(zhì)中顆粒少。窒息組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組明顯減少,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,由典型的扁平多角形細(xì)胞變?yōu)椴灰?guī)則圓形或橢圓形,折光性減弱,輪廓增強(qiáng),胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡,脂滴,顆粒樣物質(zhì),細(xì)胞間空隙加大,連接松散,細(xì)胞間可見(jiàn)較多細(xì)胞碎片。rhEPO組：細(xì)胞損傷狀況明顯得到改善,較窒息組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況明顯好轉(zhuǎn),形態(tài)明顯變好。(2)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力變化：與對(duì)照組細(xì)胞活力(A值)(0.74±0.08)相比,窒息組細(xì)胞活力(0.41±0.06)明顯降低,rhEPO組細(xì)胞活力(0.60±0.08)與窒息組和正常組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(3)免疫組織化學(xué)法測(cè)定DRP1表達(dá)：與對(duì)照組(0.24±0.03)相比,窒息組細(xì)胞DRP1表達(dá)光密度值(0.51±0.03)顯著升高,rhEPO組(0.38±0.03)較窒息組有所恢復(fù),但未恢復(fù)至對(duì)照組水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(4)免疫組織化學(xué)法測(cè)定OPA1表達(dá)：與對(duì)照組(0.47±0.02)相比,窒息組細(xì)胞OPA1表達(dá)光密度值(0.21±0.02)顯著降低,rhEPO組(0.36±0.02)較窒息組有所恢復(fù),但未恢復(fù)至對(duì)照組水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(5)投射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀(guān)察線(xiàn)粒體形態(tài)變化：對(duì)照組和rhEPO組線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)完整,基質(zhì)分布均勻,可見(jiàn)線(xiàn)粒體嵴；窒息組線(xiàn)粒體出現(xiàn)腫脹,空泡變性,基質(zhì)減少,部分嵴消失。 結(jié)論：新生兒窒息后血清可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡,其機(jī)制包括通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白DRP1、OPA1的表達(dá)水平而影響線(xiàn)粒體融合與分離平衡使線(xiàn)粒體片段化促細(xì)胞凋亡。rhEPO可通過(guò)調(diào)節(jié)OPA1、DRP1的表達(dá)抑制線(xiàn)粒體分離明顯減輕窒息后血清誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的損傷。
【圖文】：

圖2.比EPO對(duì)窒息后血清誘導(dǎo)HK一2細(xì)胞活力改變的影響Fis:2仆ee傷比tofthEPOontheeellviabilityofHK，2cellsindu以沮勿PO淞砂l(fā)yxial.selum(X紹)thEPO對(duì)窒息后血清誘導(dǎo)HK一2細(xì)胞D即1表達(dá)的影響免疫組化檢測(cè)，DRPI染色為黃褐色位于胞漿，各實(shí)驗(yàn)組HK.2細(xì)胞，與對(duì)照組相比，窒息組D即1的表達(dá)(OD值)明顯增加，rhEPO組有明顯好轉(zhuǎn)，但未恢復(fù)至對(duì)照組水平，差異具有顯著性意義(尸<0.

圖4.比丑PO對(duì)窒息后血清誘導(dǎo)HK一2細(xì)胞D即1表達(dá)的影響(OD)Fig.4.仆ee蛋雙ofrhEPOonexPressionofD即1inHK一2eellsindueedbypo坐些hyxial一serum(oD)4rhEPO對(duì)窒息后血清誘導(dǎo)HK一2細(xì)胞OPAI表達(dá)的影響免疫組化檢測(cè)，OPAI染色為黃褐色位于胞漿，，與對(duì)照組相比，窒息組OPAI的表達(dá)顯著減少，比EPO組較窒息組有明顯好轉(zhuǎn)，但未恢復(fù)至對(duì)照組水平，差異具有顯著性意義(尸<0.口J)。(見(jiàn)圖5、表3、圖6)
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R722.1

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本文編號(hào)：2642679