發(fā)布時(shí)間：2020-04-25 23:08

【摘要】：【目的】:觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)來(lái)源的外泌體對(duì)早產(chǎn)兒腦損傷模型中炎癥因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的影響,探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌作用干預(yù)早產(chǎn)兒腦損傷的相關(guān)機(jī)制。【方法】:1.取大鼠的脛、股骨骨髓,采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)、純化BMSCs;熒光倒置顯微鏡下觀察干細(xì)胞形態(tài);超高速離心法富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性的外泌體;透射電鏡確定提取外泌體的直徑大小及蛋白電泳確定外泌體特定表達(dá)的蛋白分子。2.將新生3日齡清潔級(jí)SD大鼠的乳鼠隨機(jī)分為四組:CONTROL組、WMD+PBS移植組、WMD+SUPERNATANT移植組和WMD+EXO組,制作早產(chǎn)兒腦損傷模型(white matter damage,WMD)。WMD+PBS移植組、WMD+SUPERNATANT移植組和WMD+EXO移植模型鼠經(jīng)七氟烷吸入麻醉后予結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈并吸入氧濃度為6%的氧氮混合氣體2小時(shí),制作早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷模型。對(duì)照組乳鼠麻醉后僅制作早產(chǎn)兒腦損傷模型,不做其他處理。WMD+PBS移植組造模后經(jīng)左側(cè)腦室定位注射5ulPBS液,WMD+SUPERNATANT移植組造模后經(jīng)左側(cè)腦室定位注射5ul SUPERNATANT,WMD+EXO移植組造模后經(jīng)左側(cè)腦室定位注射5ulEXO,對(duì)照組不予顱內(nèi)注射。3.模型制作成功后,除CONTROL組,其余實(shí)驗(yàn)組分別側(cè)腦室立體定向移植PBS,SUPERNATANT,EXO;采用蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察第7天腦組織病理改變;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)第7天時(shí)各組大鼠腦中IL-6,TGF-β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù);在分別干預(yù)1天、2天、3天、5天、7天后,分別采用酶聯(lián)免疫吸附和RT-PCR,檢測(cè)腦組織勻漿中各組IL-6及TGF-β的分泌含量及mRNA表達(dá)水平。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x|-)±s)表示,對(duì)于本次研究中的重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析進(jìn)行比較分析,組間兩兩比較采用BONFERRONI檢驗(yàn)。兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.01時(shí)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。【結(jié)果】:1.全骨髓貼壁法成功培養(yǎng)并提純第三代骨髓間充干細(xì)胞,第三代細(xì)胞呈旋渦狀生長(zhǎng),超高速離心法富集BMSCs-exo,通過透射電鏡鑒定外泌體形態(tài)直徑為60-80nm,Western-blot檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志蛋白CDL-1及CD63。2.干預(yù)7天后,HE染色結(jié)果顯示對(duì)照組及WMD+PBS移植組的乳鼠腦白質(zhì)區(qū)見部分細(xì)胞變性、側(cè)腦室擴(kuò)張,海馬區(qū)結(jié)構(gòu)變異明顯;WMD+SUPERNATANT移植組及WMD+EXO移植組的乳鼠腦白質(zhì)區(qū)見輕微細(xì)胞水腫、變性,但較其余兩組側(cè)腦室擴(kuò)張程度小,海馬區(qū)結(jié)構(gòu)變異輕,以WMD+EXO移植組變異程度最輕。3.免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示:CONTROL組及WMD+PBS移植組的乳鼠腦內(nèi)IL-6陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于WMD+SUPERNATANT移植組及WMD+EXO移植組移植組,(BONFERRONI檢驗(yàn),P值均0.05);CONTROL組及WMD+PBS移植組的乳鼠腦內(nèi)TGF-β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于WMD+SUPERNATANT移植組及WMD+EXO移植組移植組,(BONFERRONI檢驗(yàn),P值均0.05)。4.ELISA顯示干預(yù)1天、2天、3天、5天和7天后,CONTROL和WMD+PBS移植組的乳鼠腦內(nèi)IL-6蛋白水平均在實(shí)驗(yàn)第5天達(dá)到峰值,隨后呈下降趨勢(shì),至第7天時(shí)仍未降至正常水平;WMD+SUPERNATANT移植組及WMD+EXO移植組的乳鼠在各時(shí)間點(diǎn)IL-6蛋白表達(dá)水平顯著低于CONTROL和WMD+PBS移植組,且第5天時(shí)間點(diǎn)中WMD+SUPERNATANT移植組及WMD+EXO移植組IL-6蛋白表達(dá)水平最低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(BONFERRONI檢驗(yàn),P值均0.05)。ELISA顯示干預(yù)1天、2天、3天、5天和7天后,CONTROL和WMD+PBS移植組的乳鼠腦內(nèi)TGF-β蛋白水平均在實(shí)驗(yàn)第5天降至最低,隨后稍呈增長(zhǎng)趨勢(shì),至第7天時(shí)仍未升至正常水平;WMD+SUPERNATANT移植組及WMD+EXO移植組的乳鼠第5天時(shí)間點(diǎn)后TGF-β蛋白表達(dá)水平顯著高于CONTROL和WMD+PBS移植組,后呈明顯上升趨勢(shì),且各時(shí)間點(diǎn)中WMD+SUPERNATANT移植組及WMD+EXO移植組TGF-β蛋白表達(dá)水平與CONTROL組對(duì)比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(BONFERRONI檢驗(yàn),P值均0.05)。【結(jié)論】:本實(shí)驗(yàn)成功收集培養(yǎng)細(xì)胞上清液及富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體,并通過透射電鏡鑒定鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體形態(tài)為類圓形,直徑均值為60-80nm,Weatern-blot鑒定外泌體特異表達(dá)表面標(biāo)志分子CAL-1及CD63;3日齡乳鼠予缺血缺氧處理造成的鼠模型符合早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷病理學(xué)改變。SUPERNATANT及BMSCs-EXO移植可以有效改善乳鼠大腦中受損細(xì)胞的形態(tài)及海馬區(qū)變異程度,其中以EXO移植組效果最為顯著,其改善缺氧缺血導(dǎo)致的腦損傷,調(diào)節(jié)腦內(nèi)免疫炎癥機(jī)制,可能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以旁分泌作用,胞吐形式分泌的外泌體攜帶調(diào)控神經(jīng)炎癥的相關(guān)RNA,下調(diào)促炎癥因子IL-6及上調(diào)抑炎癥因子TGF-β的表達(dá)有關(guān);證實(shí)BMSCs-exosome具有神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)、減輕早期炎癥反應(yīng)有關(guān)的作用。
【圖文】：

1.4 分離實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)乳鼠腦制取鼠腦標(biāo)本，乳鼠于吸入性七氟烷麻醉后，鼠俯臥位，于頸后部“十”字乳鼠皮膚后，手術(shù)剪離斷全部鼠頸，矢狀面分開鼠腦殼，于冠狀溝處分開腦鑷子小心撥開外層腦殼暴露實(shí)質(zhì)腦，提取冠狀溝前部全部腦，留取作后續(xù)實(shí)見圖 1-D）。對(duì)于需留取灌注后的鼠腦標(biāo)本實(shí)驗(yàn)，乳鼠于吸入性七氟烷麻醉后，鼠仰臥位動(dòng)物試驗(yàn)臺(tái)上，膈肌處分離表層皮膚及各層結(jié)締組織，手術(shù)剪離斷胸骨，分右兩側(cè)肋骨粘連皮膚，充分暴露心臟，保證在心臟跳動(dòng)情況下，心尖處及對(duì)開一針孔大小，依次灌入 2 次 5ml 生理鹽水-2 次多聚甲醛后，鼠俯臥位，后部“十”字切開乳鼠皮膚后，手術(shù)剪離斷全部鼠頸，矢狀面分開鼠腦殼，狀溝處分開腦殼，鑷子小心撥開外層腦殼暴露實(shí)質(zhì)腦，，可見全白透明鼠腦，冠狀溝前部全部腦，留取標(biāo)本作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表 1 不同時(shí)間點(diǎn)各組體質(zhì)量表（x±s，g）Groups Beforetransplantation1dayaftersurgery2dayaftersurgery3dayaftersurgery5dayaftersurgery7asCONTROL 8.0 ±0.628.1 ±0.838.2 ±0.858.4 ±0.839.1 ±0.7990WMD+PBS 7.9 ±0.858.0 ±0.758.1 ±0.858.7 ±0.789.5 ±0.6810WMD+SUPERNATANT8.1 ±0.788.1 ±0.838.3 ±0.889.6 ±0.9810.8 ±0.9410WMD+EXO 8.2 ±0.598.1 ±0.888.4 ±0.939.8 ±0.94ab12.3 ±0.88ab10F 1.33 1.40 1.58 20.17 30.44 4P 0.87 0.79 0.65 0.038 0.041 0注 ： 與 對(duì) 照 組 相 比 ，aP<0.05 ； 與 WMD+PBS 組 相 比 ，bP<
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R722.6

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本文編號(hào)：2640795