【摘要】：研究背景 急性白血病(Acute lekemia,AL)占小兒惡性腫瘤的首位,任何年齡均可發(fā)病,但以學(xué)齡前期兒童多見。我國0-10歲兒童白血病的發(fā)病率為3/10萬-4/10萬,嚴(yán)重威脅著兒童的健康。近20多年來,兒童急性白血病完全緩解(CR)率和5年無病生存率已經(jīng)得到明顯的提高。兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)通過化療CR率已高達(dá)96-99%,5年無病生存率也達(dá)70%-80%,但是仍有約20%的患者治療失敗。尤其是急性髓性白血病(AML)的療效遠(yuǎn)不如ALL,兒童AML的長期無病存活率不足60%。 白血病細(xì)胞對化療藥物耐藥是治療失敗的重要原因,然而,我們對白血病細(xì)胞內(nèi)在的分子生物學(xué)特性還不是很清楚,白血病細(xì)胞增殖與耐藥性是目前白血病治療研究的熱點之一。為了進(jìn)一步認(rèn)識白血病細(xì)胞的分子生物學(xué)特性和白血病細(xì)胞信號通路與白血病化療敏感性的關(guān)系,我們研究與白血病細(xì)胞生存密切相關(guān)的信號通路,如PI3K/AKT、RAS/RAFMEK/ERK和JAK/STAT通路等,進(jìn)行了初步的研究�，F(xiàn)在已有研究證明這些通路與白血病發(fā)生、白血病細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和引起細(xì)胞耐藥相關(guān)。針對信號通路的分子靶向藥物,部分已經(jīng)進(jìn)入臨床實驗階段。 近年來,流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞信號通路的檢測,發(fā)展出磷酸化流式細(xì)胞術(shù)(Phospho-specific flow cytometry, phospho-flow)。Phospho-flow能從單個細(xì)胞水平檢測白血病細(xì)胞信號蛋白的激活,同時分析多個磷酸化信號蛋白之間的關(guān)系。Phospho-flow可應(yīng)用于白血病以信號通路為基礎(chǔ)的危險分型研究、新藥開發(fā)的實驗研究和分子靶向藥物臨床實驗的藥效監(jiān)測,Phospho-flow具有潛在的臨床應(yīng)用價值。因此,我們建立Phospho- flow檢測白血病患兒白血病細(xì)胞內(nèi)磷酸化信號通路的實驗方法,探討Phospho- flow在白血病實驗研究及臨床應(yīng)用。 P-AKT是PI3K/AKT通路中AKT的激活形式、P-ERK1/2是RAS/RAF/MEK/ERK通路的的激活形式、JAK/STAT通路的P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6,這3個通路的激活均與細(xì)胞的生存、凋亡相關(guān),有多項研究發(fā)現(xiàn),他們還與白血病細(xì)胞的耐藥有相關(guān)性。因此,我們采用Phospho-flow技術(shù)檢測初診兒童白血病細(xì)胞磷酸化蛋白即P-AKT、P-ERK1/2和P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6的表達(dá),分析PI3K/AKT、RAS/RAF/MEK/ERKJAK/STAT通路與患兒危險分型、藥物治療反應(yīng)之間以及急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia ,ALL)高危分型之間的關(guān)系,探討Phospho-flow技術(shù)的臨床應(yīng)用價值。 目的 1.在本實驗室建立流式細(xì)胞術(shù)檢測白血病患兒骨髓或外周血細(xì)胞磷酸化信號蛋白的磷酸化流式細(xì)胞技術(shù); 2.采用磷酸化流式細(xì)胞術(shù)檢測白血病患兒骨髓或外周血白血病細(xì)胞內(nèi)信號通路磷酸化蛋白的表達(dá),了解兒童白血病細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白P-ERK1/2、P-AKT、P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5和P-STAT6的表達(dá),分析PI3K/AKT、RAS/RAF/MEK/ERK、JAK/STAT通路與患兒危險分型、藥物治療反應(yīng)之間以及ALL高危分型之間的關(guān)系,探討Phospho-flow技術(shù)的臨床應(yīng)用價值。 方法 1.流式細(xì)胞術(shù)檢測K562細(xì)胞株的磷酸化蛋白 (1)將P-AKT、P-ERK1/2表達(dá)陽性的K562細(xì)胞株作為陽性對照細(xì)胞,U0126(MEK阻滯劑)和LY294002(PI3K阻滯劑)阻滯的K562細(xì)胞作為陰性對照細(xì)胞。 (2)細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白的固定:根據(jù)Sue Chow等的Phospho- flow實驗方法,采用終濃度為4%的甲醛,在37℃中孵育10min固定細(xì)胞。 (3)細(xì)胞破膜:①加入1ml含90%甲醇的破膜工作液,將細(xì)胞管置于冰中孵育30min(根據(jù)BD公司說明書);②加入1ml含50%甲醇的破膜工作液,細(xì)胞管置于室溫下孵育10min。 (4)加入抗體:每組細(xì)胞均分為IgG對照管和磷酸化抗體管: IGG對照管:IgG1- Alexa 488和IgG1-Alexa 647磷酸化抗體管:P-ERK1/2- Alexa 488和P-AKT- Alexa 647各熒光抗體加入20ul,在室溫中避光孵育30min,洗滌后上流式細(xì)胞術(shù)分析 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測白血病患兒骨髓白血病細(xì)胞的磷酸化蛋白骨髓標(biāo)本不同處理方法的比較 (1)提取骨髓單個核細(xì)胞后固定白血病細(xì)胞:使用梯度密度離心法分離單個核細(xì)胞后,采用4%的甲醛固定,準(zhǔn)備破膜。破膜:每管加入1ml含90%甲醇的破膜工作液,將細(xì)胞管置于冰中孵育30min。 (2)固定白血病細(xì)胞同時裂解紅細(xì)胞:取患兒100ul骨髓或全血,每管加入固定\紅細(xì)胞裂解液1×buffer 2mL,在37℃水浴中10min(根據(jù)BD公司試劑說明書);每管加入1ml含90%甲醇的破膜工作液,將細(xì)胞管置于冰中孵育30min(根據(jù)BD公司說明書)。 細(xì)胞的熒光抗體標(biāo)記 (1)加入細(xì)胞表面CD抗體,識別幼稚細(xì)胞群: B-ALL: CD45-Percp/CD10-FITC/CD19-PE/CD34-APC AML: CD45-Percp/CD13-FITC/CD33-PE /CD34-APC T-ALL:CD45-Percp/CD5-FITC/CD7-PE /CD34-APC (2)細(xì)胞內(nèi)磷酸化抗體標(biāo)記:對照管:CD45-Percp/IgG1-Alexa 488/IgG1-PE/IgG1-Alexa 647;磷酸化蛋白檢測管: CD45Percp/P-ERK1/2-Alexa-488/P-AKT-Alexa 647/CD34-PE或CD45Percp/P-ERK1/2-PE/P-AKT-Alexa 647/CD34-APC (根據(jù)每個患者表達(dá)CD表達(dá)調(diào)整磷酸化抗體與CD抗體的組合) 3.流式細(xì)胞術(shù)分析磷酸化蛋白 采用FACSCanto流式細(xì)胞儀分析,K562細(xì)胞株陽性對照組作為骨髓白血病細(xì)胞檢測P-AKT、P-ERK1/2的陽性對照細(xì)胞,K562細(xì)胞株陰性對照組作為P-AKT、P-ERK1/2的陰性對照。根據(jù)K562的陽性和陰性對照分析白血病患兒P-AKT、P-ERK1/2是陽性或陰性表達(dá)。 提取單個核細(xì)胞處理方法(骨髓提取單個核細(xì)胞后,固定破膜處理細(xì)胞方法)的細(xì)胞管,在流式細(xì)胞儀分析時采用光散射圖(FSC/SSC)設(shè)門;直接全血方法(固定白血病細(xì)胞同時裂解紅細(xì)胞處理方法)的細(xì)胞管,采用CD45/SSC聯(lián)合設(shè)門分析白血病幼稚細(xì)胞。兩個處理方法在設(shè)門后,均同時聯(lián)合細(xì)胞表面CD抗原(CD10、CD34、CD5、CD7、CD33等)分析磷酸化蛋白P-AKT、P-ERK1/2。 4.采用磷酸化流式細(xì)胞術(shù)檢測即P-AKT、P-ERK1/2和P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6 磷酸化流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞處理(直接全血方法):固定白血病同時裂解紅細(xì)胞:取患兒100 ul骨髓或全血,每管加入固定\紅細(xì)胞裂解液1×buffer 2ml,將細(xì)胞管置于37℃水浴中10min,洗滌。每管加入含1ml 90%甲醇的破膜工作液,將細(xì)胞管置于冰中孵育30min。加入CD表面抗體和磷酸化抗體孵育后,流式細(xì)胞儀分析。 結(jié)果 1.流式細(xì)胞術(shù)檢測K562細(xì)胞的磷酸化蛋白:K562陽性管可見有P-AKT、P-ERK1/2的陽性表達(dá);U0126(MEK阻滯劑)和LY294002(PI3K阻滯劑)處理的陰性管可見P-AKT、P-ERK1/2無陽性表達(dá)。 2.兩種破膜方法處理K562細(xì)胞的比較: K562細(xì)胞采用90%甲醇與50%甲醇破膜處理,P-AKT陽性率分別為(52.5±8.7)%和(36.8±9.3)%,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;其P-ERK1/2的陽性率分別為(45.7±10.7)%和(28.8±12.1)%,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 3.比較兩種細(xì)胞處理方法檢測骨髓白血病細(xì)胞磷酸化蛋白的差異 提取單個核細(xì)胞處理與固定白血病細(xì)胞同時裂解紅細(xì)胞處理骨髓,檢測26例患兒白血病細(xì)胞的P-AKT的陽性率分別為46.2%和50.0%(P0.05),兩種處理方法無統(tǒng)計學(xué)差異。 提取單個核細(xì)胞處理與固定白血病細(xì)胞同時裂解紅細(xì)胞處理骨髓,檢測26例白血病患兒白血病細(xì)胞的P-ERK1/2的陽性率分別為30.8%和38.5%(P0.05),兩種方法無統(tǒng)計學(xué)差異。 4. 9例非M3 AML患兒各磷酸化蛋白的表達(dá):P-AKT為55.5%,P-ERK為44.4%,P-STAT5為33.3%,P-STAT6為55.5%, P-STAT1、P-STAT3均為0.0%。9例患者表達(dá)磷酸化蛋白各有差異。 5. 17例B-ALL患兒各磷酸化蛋白的表達(dá):P-AKT陽性率為35.3%;P-ERK1/2陽性率為11.8%;P-STAT1陽性率為0.0%;P-STAT3陽性率為0.0%;P-STAT5陽性率為11.8%;P-STAT6陽性率為17.6%。7例磷酸化蛋白表達(dá)陽性的B-ALL患兒中,他們所表達(dá)的磷酸化蛋白種類各有差異。3例患兒有1種以上磷酸化蛋白表達(dá),他們表達(dá)不同的磷酸化蛋白。 6.15例停藥一年以上白血病患兒(對照組)的P-AKT、P-ERK1/2、P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6的表達(dá):均為陰性。 7. ALL患兒P-AKT表達(dá)陽性組與陰性組WBC的差異:P-AKT陽性組與陰性組的WBC分別為(157.6±131.2)×10~9/ml和(26.6±19.8)×10~9/ml,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 8. ALL白血病磷酸化蛋白表達(dá)陽性組與陰性組患兒早期治療反應(yīng)(D8、D19)之間關(guān)系:ALL患兒P-AKT、P-ERK1/2、P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6的表達(dá)陽性與陰性在D8天潑尼松誘導(dǎo)試驗的敏感性上均無明顯差異;在D19天早期誘導(dǎo)治療反應(yīng)上均無明顯差異。在所檢測的6個磷酸化蛋白中,存在2個以上磷酸化蛋白表達(dá)陽性的AL患兒與早期治療反應(yīng)不佳之間可能存在相關(guān)性。 9. ALL白血病磷酸化蛋白表達(dá)陽性組與陰性組患兒誘導(dǎo)治療完全緩解(D33)之間關(guān)系:所有ALL在誘導(dǎo)治療的D33天均完全緩解,在誘導(dǎo)治療D33天完全緩解率與各磷酸化蛋白表達(dá)陽性無相關(guān)性。 10. ALL患者各磷酸化蛋白P-AKT、P-ERK1/2、P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6表達(dá)陽性與陰性在白血病高危分型之間的關(guān)系:B-ALL患兒P-AKT陽性組與陰性組的高危型百分率分別為87.5%和0%,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。P-ERK1/2、P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6陽性組與陰性組的高危型百分率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。 全文結(jié)論 1. 4%的甲醛固定磷酸化蛋白和90%甲醇破膜細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)方法可用于細(xì)胞株和單個細(xì)胞懸液的實驗研究。 2.固定/裂解紅細(xì)胞液處理白血病患者PM或BM固定細(xì)胞,90%甲醇破膜細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)方法,可用于白血病信號通路的臨床實驗研究。 3.我們應(yīng)用磷酸化流式細(xì)胞術(shù)對兒童急性白血病的磷酸化信號蛋白進(jìn)行了初步觀察,證實兒童白血病細(xì)胞存在AKT、ERK1/2、STAT5和STAT6的激活。 4.白血病細(xì)胞信號蛋白P-AKT、P-ERK1/2、STAT5和STAT6的表達(dá),有可能作為白血病的分子標(biāo)志。P-AKT可能作為白血病高危分型的實驗指標(biāo)之一,有關(guān)這些信號蛋白在兒童白血病細(xì)胞表達(dá)的分子生物學(xué)意義與臨床應(yīng)用價值,有待進(jìn)一步的深入研究。
【圖文】：

RAF/MEK/ERK通路和JAK/STAT通路也存在相互作用[15](圖1)。因此，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測初診患兒白血病細(xì)胞存在多個磷酸化信號蛋白激活的患兒可能具有高的耐藥性�？赡茏鳛榛純焊呶５奈ｋU標(biāo)志。信號蛋白的分子靶向治療隨著伊馬替尼有效治療BCR-ABL陽性的慢性粒細(xì)胞白血�。–ML），看到了分子靶向藥物在白血病中的治療應(yīng)用前景。針對這些信號蛋白靶向治療的一個優(yōu)點是，我們不需要知道是哪一種基因突變引起的信號通路激活，只要使用通路抑制劑就可達(dá)到治療的效果�，F(xiàn)在抑制信號蛋白持續(xù)性激活的分子靶向藥物正在基礎(chǔ)和臨床實驗研究中。根據(jù)患者激活的信號蛋白類型，選擇相應(yīng)的分子靶向藥物進(jìn)行治療。有研究發(fā)現(xiàn)AKT抑制劑在癌癥細(xì)胞中可能具有多效性，采用AKT抑制劑可阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，起到抗腫瘤效應(yīng)。Nyakern M等[16]在白血病T細(xì)胞的體外試驗中證明，派立福辛（AKT抑制劑）與傳統(tǒng)的化療藥物依托泊苷聯(lián)合使用具有協(xié)同效應(yīng)

29圖3 B-ALL患兒的磷酸化流式圖：骨髓經(jīng)固定/裂解液直接固定白血病細(xì)胞和裂解紅細(xì)胞90%甲醇破膜處理后，流式細(xì)胞術(shù)分析幼稚細(xì)胞P-AKT、P-ERK1/2表達(dá)。A:為SSC/CD45圖設(shè)門幼稚細(xì)胞群P1；B：為幼稚細(xì)胞群P1的CD34/CD19的表達(dá)，可見幼稚有明顯的CD34+/CD19+占48%；C、E分別為P-AKT、CD34和P-ERK、CD34的同型陰性對照；D：CD34/P-AKT圖，，P-AKT占幼稚細(xì)胞的34%，其中CD34+/P-AKT+為18%，CD34-/P-AKT+14%，F(xiàn) ：為CD34/P-ERK1/2 圖， 可見P-ERK1/2+ 占幼稚細(xì)胞的3.6% ， 其中CD34+/P-ERK1/2+為2%，CD34-/P-ERK1/2+為1.6%
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R733.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 梁愛斌,李莉,謝曉恬,江華,葉輝,趙金彩;不同危險分組ALL細(xì)胞PI3K/AKT磷酸化激活的初步研究[J];同濟大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2005年01期

2 顧龍君;;兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議(第三次修訂草案)[J];中華兒科雜志;2006年05期

本文編號：2633083