發(fā)布時間：2020-04-13 08:30

【摘要】： 前言 新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是新生兒死亡和兒童永久性神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的主要原因之一，新生兒HIE發(fā)病機制尚不十分清楚。近年來的一些研究表明，線粒體在HIE的發(fā)病過程中起關(guān)鍵性的作用，線粒體的主要功能為能量代謝，為各種生命活動提供能源。缺氧缺血(HI)后線粒體能量代謝異常在HIE的發(fā)生和發(fā)展過程中起主導(dǎo)作用。關(guān)于二次能量代謝衰竭的時間和程度報導(dǎo)不一，國外采用磁共振波譜學(xué)研究新生兒HIE的能量變化過程，動物模型以新生豬缺氧缺血腦損傷(HIBD)研究較多，目前國內(nèi)關(guān)于新生兒和(或)新生動物HI后能量代謝變化研究報導(dǎo)的甚少，線粒體形態(tài)和功能變化與神經(jīng)細胞死亡的關(guān)系尚不十分清楚。 本實驗應(yīng)用新生鼠HIBD模型，檢測皮質(zhì)神經(jīng)細胞PCr、ATP、ATP+ADP+AMP的含量變化，動態(tài)反映HI后0h～72h，10個不同時間點的能量代謝變化過程，同時在透射電鏡下觀察線粒體在相應(yīng)時間點的形態(tài)變化，將能量代謝狀況與形態(tài)學(xué)的研究相結(jié)合，探討線粒體和神經(jīng)細胞形態(tài)變化與細胞能量代謝的關(guān)系，為將來HIE干預(yù)手段的研究奠定基礎(chǔ)。 材料與方法 1．制作新生大鼠HIBD模型：7日齡Wistar大鼠，雌雄不限，體重11g-18g，行左側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù)，氧濃度8％，缺氧時間為1.5h，隨機分組：假手術(shù)對照組(n=6)于假手術(shù)后恢復(fù)4h處死，HIBD模型組又隨機分為10組(n=6)，分別于HI后0h、2h、4h、 6h、sh＊oh、12h、24h、48h和72h處死。 2．標本留�。簞冸x左側(cè)大腦皮質(zhì)，在左頂枕部皮質(zhì)取直徑約2 －3rum大小組織標本，放人2．5％戊H醛中固定，余下的左側(cè)頂枕 部皮質(zhì)迅速置于一196℃液氮中，24h后移至一80℃冰箱中保存。 3．透射電鏡檢查：常規(guī)電鏡制作過程，透射電鏡觀察線粒體形 態(tài)及細胞超微結(jié)構(gòu)。 4．融液相色譜方法檢測皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)PCr人TP人DP和 AMP的含量。 5．統(tǒng)計學(xué)處理：各組實驗數(shù)據(jù)平均數(shù)的比較采用單因素方差 分析對I組與對照組采用Tukey法檢驗。應(yīng)用SPSS 10．0統(tǒng)計軟 件進行統(tǒng)計分析。 結(jié) 果 二．透射電鏡觀察結(jié)果 HI后加：線粒體結(jié)構(gòu)基本正常，外膜大部分完整，部分模糊， 崎內(nèi)腔無明顯擴大，基質(zhì)內(nèi)有輕度的電子高密度區(qū)。 HI后sh：胞漿內(nèi)同時可見到不同程度損傷及正常的線粒體， 損傷較重的線粒體外膜部分斷裂，線粒體峙紊亂，基質(zhì)分布不均 勻，同時可見外膜完整、峻問腔小空泡變性的線粒體，也可見到呢 消失、空泡變性的線粒體，還可見到外膜完整，峪結(jié)構(gòu)清楚、基質(zhì)分 布較均勻的線粒體。 HI后24h：可見線粒體大部分溶解，結(jié)構(gòu)模糊不清，同時可見 細胞核膜斷裂溶解，核仁可見。 HI后 48 h：細胞內(nèi)可見空泡變性的線粒體，細胞器大部分溶 解，結(jié)構(gòu)模糊，細胞間界線不清，細胞核溶解，核仁消失。 2．PCr ＊TP和 A＊＋ADP＋AMP的結(jié)果 PCr于 HI后立即下降對I后 6h下降到對照組的 50．78％，明 ·2· 顯低于對照組（P＜0．of）。于＊后10 h恢復(fù)到正常對照組的 9二．93呢，與對照組比較無明顯下降（P＞O．05人于＊后2油出 現(xiàn)第二次下降，為對照組的58．06暢，明顯低于對照組（P＜O．01入 ATP于＊后立即下降，HI后Zh下降到對照組的71．36％，明 顯低于對照組（P＜O．01人于＊后12h恢復(fù)到正常對照組的 83．05呢，與對照組比較無明顯下降（P＞o．05人于＊1后48h出現(xiàn) 第二次下降，為對照組的61．10％，明顯低于對照組門＜O．01八 ATP＋ADP＋AMP于 HI后立即下降，為正常對照組的 50． 14暢，明顯低于對照組（P＜O．01人于＊1后sh恢復(fù)到對照組的 8293暢，與對照組比較無明顯下降河＞o．05人于＊后階卜第二 次下降，為對照組的32．56％，明顯低于對照組（P功對門。 討 論 1．缺氧缺血后線粒體形態(tài)改變 本實驗研究表明線粒體在HI后立刻出現(xiàn)輕度外膜的損傷，于 HI后 8 h在胞漿內(nèi)同時出現(xiàn)不同程度損傷的線粒體和結(jié)構(gòu)正常的 線粒體，在此時間點細胞內(nèi)高能磷酸物質(zhì)部分恢復(fù)，，表明線粒體氧 化磷酸化的功能部分恢復(fù)，雖然存在部分損傷的線粒體，但對整個 細胞ATP的含量影響不大。 在HI后24h和48h，線粒體損傷達到高峰，同時出現(xiàn)細胞漿 溶解、細胞核溶解、核仁消失，呈現(xiàn)細胞壞死的形態(tài)學(xué)改變。本實 驗觀察結(jié)果表明，線粒體損傷的嚴重程度與皮質(zhì)神經(jīng)細胞損傷有 密切聯(lián)系，而且線粒體及細胞損傷的嚴重程度與皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi) 高能磷酸物質(zhì)的下降相一致。 入HI后線粒體生成ATP的功能發(fā)生改變 本實驗研究結(jié)果表明新生大鼠HI后皮質(zhì)神經(jīng)細胞內(nèi)這些高 能磷酸物質(zhì)存在二次下降，衡量線粒體功能的指標有很多，包括線 ·3· 粒體合成ATP的能力、線粒體呼吸控制比（RCR人組成呼吸連的 酶和輔酶的活力和含量，本實驗通過檢測細胞內(nèi) PCr、ATP、ATP＋ ADP＋AMP反映線粒體能量代謝的功能，表明線粒體功能在 HI 過程中發(fā)生改變，關(guān)于HI后線粒體損傷的機制尚不十分清楚，早 期損傷
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R722.1

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本文編號：2625810