【摘要】：背景和目的:發(fā)育性髖臼發(fā)育不良(DDH)是小兒骨科最常見的先天性畸形,致殘率高,病因不清。既往DDH病因研究主要集中在Y型軟骨,近期我們的3D-CT和MRI研究證實(shí)DDH患兒髖臼頂壁存在軟骨骨化異常,但其具體機(jī)制尚不明確。研究表明microRNA對(duì)于軟骨細(xì)胞增殖、分化以及軟骨骨化的調(diào)控具有重要作用,但其在DDH的研究尚無報(bào)道。本課題擬通過伸直襁褓體位構(gòu)建DDH動(dòng)物模型,表達(dá)譜芯片分析髖臼頂壁軟骨microRNA異常表達(dá),生物信息學(xué)預(yù)測其靶基因,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)論證microRNA及其靶基因信號(hào)通路參與調(diào)控DDH髖臼頂壁軟骨骨化延遲的分子生物學(xué)機(jī)制。方法:(1)使用4周齡兔進(jìn)行左下肢石膏固定模擬伸直襁褓體位建立髖臼發(fā)育不良模型,以對(duì)側(cè)髖作為對(duì)照,通過X線檢測評(píng)判是否造模成功;(2)通過X線、MRI、組織大體標(biāo)本和番紅O-快綠染色檢測髖臼頂壁軟骨的異常改變;透射電鏡檢測細(xì)胞器結(jié)構(gòu)改變;(3)對(duì)模型組和對(duì)照組髖臼頂壁軟骨標(biāo)本進(jìn)行miRNA差異表達(dá)分析,并篩選出與軟骨發(fā)育密切相關(guān)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證;原位雜交檢測miRNA在髖臼頂壁軟骨上的表達(dá)。(4)兔髖臼軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng),取第2代細(xì)胞進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫熒光染色;(5)熒光素酶表達(dá)實(shí)驗(yàn)檢測篩選的miRNA與下游基因的靶向關(guān)系;(6)下調(diào)篩選出的miRNA,通過PCR、Western blot檢測下游靶基因的表達(dá)改變,CCK-8法檢測軟骨細(xì)胞的增殖率。ELISA檢測軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖分泌。TUNEL檢測軟骨細(xì)胞凋亡。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建髖臼發(fā)育不良兔13只,MRI結(jié)果提示髖臼頂壁軟骨出現(xiàn)骨化異常,番紅O-快綠染色發(fā)現(xiàn)模型組較對(duì)照組髖臼頂壁軟骨明顯增厚。透射電鏡檢測顯示模型組軟骨細(xì)胞細(xì)胞核碎裂,細(xì)胞器減少;(2)miRNA基因芯片及驗(yàn)證表明miR-129在模型組低表達(dá)。原位雜交示miR-129髖臼頂壁軟骨中表達(dá);(3)軟骨細(xì)胞呈三角形或梭形貼壁生長。ColⅡ免疫熒光染色見細(xì)胞質(zhì)紅色熒光;(4)熒光素酶表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-129靶向調(diào)控Smad3;PCR、Western blot證實(shí)下調(diào)miR-129靶向升高Smad3,導(dǎo)致IHH低表達(dá)影響軟骨細(xì)胞增殖和分化,CCK8軟骨細(xì)胞增殖率顯著降低。ELISA示軟骨細(xì)胞PG分泌減低,ColⅡ無明顯改變。TUNEL示軟骨細(xì)胞凋亡增加。結(jié)論:本課題首次證實(shí)miR-129在軟骨細(xì)胞中表達(dá),低表達(dá)miR-129靶向升高Smad3,導(dǎo)致IHH低表達(dá),抑制軟骨細(xì)胞增殖和分化,軟骨細(xì)胞出現(xiàn)骨化延遲。miR-129有望成為DDH早期診斷的分子標(biāo)記物和新的治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

髖臼頂壁軟骨番紅O-快綠染色(A)對(duì)照組；(B)模型組
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R726.8

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 趙小明;王恩波;李建軍;周春芳;趙群;張立軍;;下肢伸直襁褓體位對(duì)髖臼軟骨復(fù)合體發(fā)育影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2009年10期

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本文編號(hào)：2624011