【摘要】：背景和目的:發(fā)育性髖臼發(fā)育不良(DDH)是小兒骨科最常見的先天性畸形,致殘率高,病因不清。既往DDH病因研究主要集中在Y型軟骨,近期我們的3D-CT和MRI研究證實DDH患兒髖臼頂壁存在軟骨骨化異常,但其具體機制尚不明確。研究表明microRNA對于軟骨細胞增殖、分化以及軟骨骨化的調控具有重要作用,但其在DDH的研究尚無報道。本課題擬通過伸直襁褓體位構建DDH動物模型,表達譜芯片分析髖臼頂壁軟骨microRNA異常表達,生物信息學預測其靶基因,體外細胞實驗論證microRNA及其靶基因信號通路參與調控DDH髖臼頂壁軟骨骨化延遲的分子生物學機制。方法:(1)使用4周齡兔進行左下肢石膏固定模擬伸直襁褓體位建立髖臼發(fā)育不良模型,以對側髖作為對照,通過X線檢測評判是否造模成功;(2)通過X線、MRI、組織大體標本和番紅O-快綠染色檢測髖臼頂壁軟骨的異常改變;透射電鏡檢測細胞器結構改變;(3)對模型組和對照組髖臼頂壁軟骨標本進行miRNA差異表達分析,并篩選出與軟骨發(fā)育密切相關的miRNA進行驗證;原位雜交檢測miRNA在髖臼頂壁軟骨上的表達。(4)兔髖臼軟骨細胞分離培養(yǎng),取第2代細胞進行Ⅱ型膠原免疫熒光染色;(5)熒光素酶表達實驗檢測篩選的miRNA與下游基因的靶向關系;(6)下調篩選出的miRNA,通過PCR、Western blot檢測下游靶基因的表達改變,CCK-8法檢測軟骨細胞的增殖率。ELISA檢測軟骨細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖分泌。TUNEL檢測軟骨細胞凋亡。結果:(1)成功構建髖臼發(fā)育不良兔13只,MRI結果提示髖臼頂壁軟骨出現(xiàn)骨化異常,番紅O-快綠染色發(fā)現(xiàn)模型組較對照組髖臼頂壁軟骨明顯增厚。透射電鏡檢測顯示模型組軟骨細胞細胞核碎裂,細胞器減少;(2)miRNA基因芯片及驗證表明miR-129在模型組低表達。原位雜交示miR-129髖臼頂壁軟骨中表達;(3)軟骨細胞呈三角形或梭形貼壁生長。ColⅡ免疫熒光染色見細胞質紅色熒光;(4)熒光素酶表達實驗證實miR-129靶向調控Smad3;PCR、Western blot證實下調miR-129靶向升高Smad3,導致IHH低表達影響軟骨細胞增殖和分化,CCK8軟骨細胞增殖率顯著降低。ELISA示軟骨細胞PG分泌減低,ColⅡ無明顯改變。TUNEL示軟骨細胞凋亡增加。結論:本課題首次證實miR-129在軟骨細胞中表達,低表達miR-129靶向升高Smad3,導致IHH低表達,抑制軟骨細胞增殖和分化,軟骨細胞出現(xiàn)骨化延遲。miR-129有望成為DDH早期診斷的分子標記物和新的治療靶點。
【圖文】：

軟骨細胞的形態(tài)學表現(xiàn)

髖臼頂壁軟骨番紅O-快綠染色(A)對照組；(B)模型組
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R726.8

【參考文獻】

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1 趙小明;王恩波;李建軍;周春芳;趙群;張立軍;;下肢伸直襁褓體位對髖臼軟骨復合體發(fā)育影響的實驗研究[J];中國當代兒科雜志;2009年10期

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本文編號：2624011