【摘要】：目的:中性粒細(xì)胞可通過形成中性粒細(xì)胞胞外捕獲網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用。機(jī)體NETs的免疫反應(yīng)和表達(dá)量與疾病病癥存在一定的相關(guān)性。流行于荒漠地帶嬰兒利什曼感染誘發(fā)的內(nèi)臟利什曼病(亦稱黑熱病)在我國(guó)流行區(qū)最廣,危害最嚴(yán)重,尚無有效防制措施。研究我國(guó)嬰兒利什曼原蟲感染在中性粒細(xì)胞形成NETs方面的作用及其機(jī)制,對(duì)了解該原蟲感染免疫調(diào)控機(jī)制和探索潛在治療靶標(biāo)提供重要的理論依據(jù)和分子基礎(chǔ)。本研究采用致荒漠型黑熱病的嬰兒利什曼原蟲新疆伽師株(MHOM/CN/2008/JIASHI-5),以下簡(jiǎn)稱嬰兒利什曼原蟲,建立嬰兒利什曼原蟲感染小鼠模型,分析嬰兒利什曼原蟲感染對(duì)宿主小鼠外周血中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs能力的影響,并進(jìn)一步探索嬰兒利什曼原蟲誘導(dǎo)NETs形成的機(jī)制。方法:以腹腔接種的方式,建立嬰兒利什曼原蟲感染BALB/c小鼠模型。分別采集感染12周小鼠和正常小鼠外周血,分離純化中性粒細(xì)胞。體外佛波酯(PMA)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs。通過激光共聚焦掃描顯微成像技術(shù)和流式細(xì)胞分析術(shù),定性和定量比較嬰兒利什曼原蟲感染小鼠與未感染小鼠中性粒細(xì)胞形成NETs的差異,分析嬰兒利什曼原蟲感染對(duì)宿主中性粒細(xì)胞形成NETs能力的影響。采集正常小鼠外周血,分離純化中性粒細(xì)胞。分別采用封閉酯氧素A4受體的拮抗劑(Boc)或刺激劑酯氧素A4(LXA4)預(yù)處理中性粒細(xì)胞以封閉或激活酯氧素A4受體。通過激光共聚焦掃描顯微成像技術(shù)、游離dsDNA濃度測(cè)定和流式細(xì)胞分析術(shù),比較不同實(shí)驗(yàn)處理組中性粒細(xì)胞在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導(dǎo)下形成NETS的差異,分析酯氧素A4受體在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs中的作用。利用1.25%二甲基亞砜(DMSO)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化為類中性粒細(xì)胞,基于RNA干擾(RNAi)技術(shù)構(gòu)建酯氧素A4受體基因表達(dá)下調(diào)的類中性粒細(xì)胞模型。流式細(xì)胞分析術(shù)比較分析酯氧素A4受體基因表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體刺激下H3Cit(NETs標(biāo)志物)表達(dá)的變化,進(jìn)一步論證酯氧素A4受體在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放NETs中的作用。結(jié)果:1.激光共聚焦掃描顯微鏡成像發(fā)現(xiàn),PMA體外刺激下,來源于嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體感染小鼠的中性粒細(xì)胞形成NETs的比例增多,絲狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯,附著在DNA骨架上的瓜氨酸化組蛋白H3(H3Cit)和髓過氧化物聚合酶(MPO)顆粒物的熒光數(shù)量增多。流式分析發(fā)現(xiàn),H3Cit+MPO+中性粒細(xì)胞占總中性粒細(xì)胞的比例為(1.880±0.251)%,未感染小鼠的中性粒細(xì)胞的H3Cit+MPO+中性粒細(xì)胞占比為(0.623±0.087)%,感染小鼠的比例明顯高于未感染小鼠(P=0.0014)。2.嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體可有效誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs(P0.01);而拮抗劑Boc封閉酯氧素A4受體后的中性粒細(xì)胞,在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導(dǎo)下NETs的釋放量顯著降低(0.01),但Boc無法完全抑制嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導(dǎo)NETs的形成;激活劑LXA4能一定程度誘導(dǎo)NETs的釋放(P0.01);拮抗劑Boc可逆轉(zhuǎn)LXA4的激活效應(yīng)(P0.01)。3.HL-60細(xì)胞分化的類中性粒細(xì)胞,在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導(dǎo)下H3Cit+類中性粒細(xì)胞的顯著增高(P0.01)。酯氧素A4受體基因表達(dá)下調(diào)的類中性粒細(xì)胞相對(duì)未干擾的類中性粒細(xì)胞,在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導(dǎo)下,H3Cit+類中性粒細(xì)胞比例顯著降低(P0.01)。結(jié)論:1.我國(guó)嬰兒利什曼原蟲感染可改變宿主中性粒細(xì)胞免疫狀態(tài),顯著增強(qiáng)中性粒細(xì)胞形成NETs的能力,并可能下調(diào)宿主免疫力。2.酯氧素A4受體是介導(dǎo)嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs的受體之一。3.中性粒細(xì)胞表面的酯氧素A4受體在利什曼原蟲感染宿主細(xì)胞中發(fā)揮重要作用,酯氧素A4受體可作為控制黑熱病的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。
【圖文】：

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本文編號(hào)：2619009