【摘要】： 目的 本實(shí)驗(yàn)制備新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型,觀察新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)mRNA、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)mRNA和caspase-3mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化以及腦組織細(xì)胞凋亡率的測(cè)定,進(jìn)一步探討缺氧缺血后新生大鼠腦水腫發(fā)生的機(jī)制和基質(zhì)金屬蛋白酶-9在腦細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制中的作用,為臨床治療新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)開(kāi)辟新的途徑。 方法 1.HIBD模型制備:將72只新生7日齡Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組、HIBD 6h、12h、24h、48h、72h組,每組大鼠12只,行頸部正中切口,分離結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈后,給予低氧(8%02,92%N2)處理2小時(shí),制成HIBD模型。假手術(shù)組只予分離但不結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈,于手術(shù)恢復(fù)后24h處死。同時(shí)觀察缺氧時(shí)動(dòng)物行為變化。 2.腦大體形態(tài)肉眼觀察:在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死時(shí)注意觀察每只新生大鼠腦組織的大體形態(tài)變化。 3.MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA和caspase-3mRNA表達(dá)的檢測(cè):每組6只新生大鼠結(jié)扎側(cè)腦組織采用Real-time Q-PCR方法測(cè)定大鼠腦組織MMP-9mRNA、TIMP-1mRNA和caspase-3mRNA的表達(dá)。 4.腦組織細(xì)胞凋亡率的檢測(cè):每組另外6只留取新鮮的結(jié)扎側(cè)腦組織使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型行為表現(xiàn):術(shù)前72只新生大鼠行為能力正常,均能正常進(jìn)食,假手術(shù)對(duì)照組未見(jiàn)行為異常表現(xiàn);HIBD組經(jīng)歷缺氧后出現(xiàn)嚴(yán)重的行為異常。 2.腦大體形態(tài)肉眼觀:假手術(shù)對(duì)照組新生大鼠大腦半球左右對(duì)稱,未見(jiàn)任何病理變化,24h時(shí)腦組織蒼白、水腫明顯,體積稍大于對(duì)側(cè)72h時(shí)可看到結(jié)扎側(cè)半球局部出現(xiàn)液化壞死灶,甚至腦組織完全液化與硬腦膜粘連。 3.MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA和caspase-3mRNA在腦組織中的表達(dá)水平: ①對(duì)照組大鼠MMP-9mRNA表達(dá)水平極低,HIBD組大鼠在經(jīng)歷缺氧缺血6h表達(dá)開(kāi)始增高,24h表達(dá)達(dá)高峰,此后漸漸下降,但在HIBD 72h仍維持較高的水平。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均比對(duì)照組高,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); ②對(duì)照組大鼠TIMP-1mRNA表達(dá)水平極低,HIBD組大鼠在經(jīng)歷缺氧缺血6h、12h、24h TIMP-1mRNA表達(dá)水平有微弱升高,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但三組間無(wú)明顯差異(P＞0.05);在48h和72h TIMP-1mRNA表達(dá)下降,與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); ③MMP-9mRNA/TIMP-1 mRNA比值在對(duì)照組比值接近1:1,HIBD組大鼠在經(jīng)歷缺氧缺血6h未見(jiàn)升高,與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);在12、24、48、72h各組均升高,在48h達(dá)到高峰,在72h有所下降,但仍高于對(duì)照組,此四組與對(duì)照組相比均有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); ④caspase-3 mRNA在對(duì)照組有低水平表達(dá),H IBD組大鼠在經(jīng)歷缺氧缺血6h就有所升高,此后其表達(dá)漸漸升高,在24h其表達(dá)達(dá)到高峰,48h其表達(dá)開(kāi)始逐漸下降,到HIBD 72h時(shí)其表達(dá)仍高于假手術(shù)對(duì)照組水平,各組與對(duì)照組相比(p＜0.01),各組間HIBD 12h和48h、HIBD 12h和72h組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MMP-9mRNA/TIMP-1 mRNA比值和caspase-3 mRNA的表達(dá)變化呈正相關(guān)(r=0.774,p＜0.01)。 4.腦組織細(xì)胞凋亡率:在假手術(shù)對(duì)照組極低,H IBD組6h亦未見(jiàn)明顯升高,而在12h腦組織細(xì)胞凋亡率則有輕微的升高,48h時(shí)達(dá)到腦細(xì)胞凋亡率的高峰,其后有所下降,但在72h時(shí)仍維持在較高水平,除HIBD6h組外,各組與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。MMP-9mRNA/TIMP-1 mRNA比值和腦細(xì)胞凋亡率的表達(dá)變化呈正相關(guān)(r=0.782,p＜0.01),腦細(xì)胞凋亡率和caspase-3mRNA表達(dá)變化呈正相關(guān)(r=0.703,p＜0.01)。 結(jié)論 1.新生大鼠HIBD模型制作成功。 2.新生大鼠腦缺氧缺血損傷后可誘導(dǎo)MMP-9mRNA表達(dá),而MMP-9mRNA和TIMP-1mRNA二者表達(dá)的失衡可能參與了新生大鼠HIBD腦水腫的形成。 3.新生大鼠腦缺氧缺血性損傷后誘導(dǎo)caspase-3mRNA表達(dá),同時(shí)腦細(xì)胞凋亡率升高,與MMP-9mRNA/TIMP-1 mRNA比值表達(dá)變化有正相關(guān)性,因此MMP-9可能參與了新生大鼠HIBD細(xì)胞凋亡的發(fā)生過(guò)程。
【圖文】：

缺氧缺血較重，不能進(jìn)食，在缺氧后48一72h死亡。另現(xiàn)體重不增和降低。形態(tài)肉眼觀組:大鼠大腦半球左右對(duì)稱，未見(jiàn)任何病理變化;組:結(jié)扎側(cè)腦組織6h時(shí)出現(xiàn)輕微水腫，體積未見(jiàn)增大，水腫明顯，體積稍大于對(duì)側(cè)，48h時(shí)腦水腫程度加重，，在72h可看到結(jié)扎側(cè)半球局部出現(xiàn)液化壞死灶，其完全液化，失去原有形狀，并與硬腦膜粘連，分離困難、T1MP一1和easpase一3基因檢測(cè)結(jié)果組織總RNA提取質(zhì)量鑒定示，，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，總RNA中的285和185兩條其EB的顯色強(qiáng)度為2:1左右，RNA完整。OD260/280RNA中沒(méi)有蛋白污染。總RNA提取結(jié)果優(yōu)(見(jiàn)圖l)。

圖21%瓊脂糖凝膠DNA電泳結(jié)果注:nLZ000M滋er6條電泳帶由上往下依次為2000bp1000bp、750bp、soobp、250bp、100bp;p一aetin產(chǎn)物長(zhǎng)度為Z17bp;樣本產(chǎn)物長(zhǎng)度easpase一3為176bp，MMP一為183bp，TIMp一l為196bp均在250bp與100bp之間。MMp一gmRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)結(jié)果大鼠MMP一gmRNA表達(dá)水平極低，HIBD組大鼠在經(jīng)歷缺高，24h表達(dá)達(dá)高峰，此后漸漸下降，但在72h仍維持較高均比對(duì)照組高，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.01);差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HIBD6h和72h組間差異則.05，見(jiàn)表l，圖3一6、11)。T1MP一1mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)結(jié)果大鼠TIMP一1mRNA表達(dá)水平極低，HIBD組大鼠在經(jīng)歷缺
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2617013