【摘要】： 急性胃黏膜損傷是嚴重感染、外傷、休克等危重癥的常見并發(fā)癥,在上述疾病中發(fā)病率可高達60-100%;未經(jīng)治療者大出血率達15%,常常危及生命。其發(fā)生原因是由于胃黏膜保護機制削弱,損傷因素相對增強所致。近年研究發(fā)現(xiàn)肽類物質(zhì)在胃粘膜損傷的保護和修復方面發(fā)揮重要作用。胃黏膜上皮的生長、更新和修復的過程是受到嚴格調(diào)控的,這一調(diào)控機制主要來自黏膜本身,有多種肽類物質(zhì)參與,其修復能力可能與這些肽類物質(zhì)的表達水平有關。在兒科危重癥中,重癥感染是急性胃黏膜損傷的常見原因。在重癥感染內(nèi)毒素血癥時肽類物質(zhì)如何發(fā)揮對胃粘膜損傷的保護和修復作用目前尚不清楚,是否是通過傳統(tǒng)的前列腺素途徑發(fā)揮作用,尚缺少研究報道。 乳癌相關肽(pS2)即三葉因子1(TFF1)為三葉肽家族一成員,其結(jié)構(gòu)是6個半胱氨酸殘基形成3個鏈內(nèi)二硫橋。pS2通過調(diào)節(jié)細胞增殖而使胃黏膜具有防御和修復功能,其對不同細胞系具有促有絲分裂作用。pS2在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中的表達變化及對胃粘膜的保護和修復作用機制尚不清楚。 轉(zhuǎn)化生長因子-alpha(TGF-α)是表皮生長因子家族中一類胃黏膜損傷后修復的主要調(diào)節(jié)肽,能促進胃黏膜上皮的代謝和生長。由于胃黏膜本身合成TGF-α,所以TGF-α是維持胃黏膜完整性最重要的肽類物質(zhì)。在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中TGF-α表達變化及pS2基因、TGF-α基因、表達的時相關系尚需研究。 環(huán)氧合酶-2(COX-2)為COX同工酶的誘導型,是前列腺素(PGs)合成過程中一個重要的限速酶。前列腺素是一種脂質(zhì),主要在精囊、腎髓質(zhì)、肺和胃腸道中合成。PG的不斷產(chǎn)生和釋放對胃黏膜細胞起保護作用,促進胃黏膜細胞愈合。在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中COX-2表達變化及調(diào)控、前列腺素E_2(Prostaglandin E_2,PGE_2)濃度變化尚不十分清楚。 誘導型一氧化氮合酶(iNOS)是NOS同工酶的誘導型,內(nèi)源性一氧化氮(NO)的產(chǎn)量有賴于細胞iNOS的表達量。在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中iNOS表達變化及調(diào)控、NO含量變化及對胃粘膜的作用尚不十分清楚。 增殖細胞核抗原(PCNA)是一種分子量為35712u(36000道爾頓)核蛋白,是細胞DNA合成不可缺少的因子,存在于細胞核內(nèi)不同部位,PC-NA的出現(xiàn)與細胞增殖周期密切相關,是反映細胞增殖活性的重要生物學指標。PCNA在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中的變化尚未見報道。 血小板活化因子(PAF)是迄今發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性潰瘍形成介子中最強的一個,對其它炎性細胞因子的作用起增強作用。PAF受體拮抗劑能顯著改變內(nèi)毒素或PAF引起的血流動力學變化及組織器官的損傷。 本研究的目的是通過觀察幼年大鼠內(nèi)毒素血癥時胃黏膜上皮細胞、壁細胞超微結(jié)構(gòu)和PGE_2、NO的變化,胃黏膜COX-2、iNOS、pS2、TGF-α蛋白及mRNA和PCNA蛋白表達變化,以及PAF受體拮抗劑對其影響,從細胞超微結(jié)構(gòu)水平、蛋白質(zhì)水平及分子水平探討內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃黏膜細胞保護作用及PAF受體拮抗劑對其影響,研究胃粘膜損傷保護和修復調(diào)控的分子機制,為胃粘膜損傷的預防和治療開辟新的途徑,也為三葉肽制劑的臨床應用提供理論依據(jù)。 材料和方法 1.材料 用腹腔注射內(nèi)毒素(5 mg/kg O_(55):B_5脂多糖)方法制備18日齡Wistar大鼠內(nèi)毒素血癥動物模型,腹腔注射同等量生理鹽水為對照組,腹腔注射內(nèi)毒素前0.5 h腹腔注射PAF受體拮抗劑(5 mg/kg BN52021 GinkgolideB)為預防組,腹腔注射內(nèi)毒素后0.5 h腹腔注射PAF受體拮抗劑(5 mg/kgBN52021 GinkgolideB)為治療組。分別于內(nèi)毒素腹腔注射后1.5,3,6,24,48,72 h斷頭處死動物,大體觀察胃黏膜損傷情況,記錄潰瘍指數(shù)(UI);在腺胃區(qū)胃大彎處取0.5cm×0.5cm胃組織置入4%甲醛溶液中固定保存、取0.1cm×0.5cm胃黏膜切成1mm~3小塊若干,投入2.5%戊二醛液中固定保存;留胃黏膜約0.5cm×0.5cm稱重;其余部分用生理鹽水沖洗3次,放入去RNA酶的試管中,液氮速凍,深低溫冰箱-70℃保存。每組每時間點8只。 2.方法 按Guth標準積分判定胃黏膜潰瘍指數(shù)(UI),H-E染色光學顯微鏡檢查胃黏膜病理改變,透射電鏡觀察胃黏膜上皮細胞、壁細胞超微結(jié)構(gòu)改變,采用放射免疫法測定胃黏膜PGE_2濃度,硝酸還原酶的化學比色法測定胃黏膜NO含量;免疫組織化學SP方法測定pS2、TGF-α、COX-2、iNOS及PC-NA蛋白的表達,半定量RT-PCR法測定pS2、TGF-α、COX-2及iNOSmRNA的表達。用SPSS 10.0軟件系統(tǒng)對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析,組間比較采用方差分析。 結(jié)果 一、內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃黏膜上皮細胞、壁細胞超微結(jié)構(gòu)變化及PAF受體拮抗劑對其影響 大體觀察LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6 h胃黏膜損傷最重,表面可見大片糜爛、出血、條索狀壞死,與胃縱軸平行,損傷主要見于腺胃區(qū);光鏡下黏膜表面上皮廣泛脫落,黏膜內(nèi)有出血,炎性細胞浸潤,核碎裂、固縮,凋亡小體出現(xiàn),腺體受損。此時胃黏膜UI記分最高,與對照組比較或各時間點比較,差異均非常顯著(P0.01);PAF受體拮抗劑預防組和治療組胃黏膜損傷程度明顯減輕,UI記分顯著降低。透射電鏡觀察可見LPS組6 h表面上皮細胞細胞間隙增寬,腔膜面破壞,細胞間緊密連接不連續(xù),短小的微絨毛減少,線粒體嚴重腫脹,脊斷裂甚至消失,呈空泡變性,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張,核糖體脫落,染色質(zhì)濃縮分部在核的周邊,可見核固縮,核膜間隙增寬;壁細胞腫脹,可見鹽酸小管擴張,部分有破壞呈空泡樣改變,線粒體增多,部分空泡樣改變,胞質(zhì)內(nèi)核糖體脫落,滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。 二、內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃黏膜COX-2、iNOS、PGE_2、NO變化及PAF受體拮抗劑對其影響 LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6 h胃黏膜PGE_2濃度最低,此時LPS組較對照組PGE_2濃度明顯降低(P0.01),PAF受體拮抗劑預防組、PAF受體拮抗劑治療組較LPS組明顯增高(P0.01),PAF受體拮抗劑預防組、PAF受體拮抗劑治療組較對照組明顯增高(P0.05)。LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6 h胃黏膜NO含量最高,此時LPS組較對照組NO含量明顯增高(P0.01),PAF受體拮抗劑預防組、PAF受體拮抗劑治療組較LPS組明顯降低(P0.01);PAF受體拮抗劑預防組、PAF受體拮抗劑治療組較對照組明顯增高(P0.05)。 對照組胃黏膜組織未見COX-2、iNOS蛋白及mRNA的表達。LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6 h COX-2蛋白在胃黏膜組織胞漿表達,48 h明顯增高,其mRNA水平亦上調(diào);PAF受體拮抗劑預防組和治療組6 h COX-2蛋白表達明顯增高、mRNA水平明顯上調(diào)。LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后1.5h胃黏膜組織胞漿iNOS蛋白表達,6 h明顯增高,24 h最高,48 h下降,72 h仍未恢復正常;其mRNA水平的表達變化與iNOS蛋白表達趨勢相同。PAF受體拮抗劑預防組和治療組3 h iNOS蛋白表達,6 h明顯增高,48 h下降,72h同正常對照組;其mRNA水平的表達變化與iNOS蛋白表達趨勢相同。 三、內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃黏膜pS2、TGF-α和PCNA表達變化及PAF受體拮抗劑對其影響 對照組胃黏膜組織胞核PCNA陽性染色很多,LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后3 h PCNA的表達就明顯減低,6 h最低,24 h有所恢復,72 h未完全恢復正常。PAF受體拮抗劑預防組和治療組胃黏膜組織胞核PCNA陽性染色無明顯減少。對照組胃黏膜組織有pS2 mRNA、TGF-αmRNA表達。LPS組內(nèi)毒素腹腔注射后1.5 h胃黏膜中pS2基因表達減弱,3 h恢復,6 h明顯高于對照組,24 h最高,48 h-72 h有所下降,但仍明顯高于對照組。PAF受體拮抗劑預防組和治療組3h pS2 mRNA的表達就明顯增強。LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6h胃黏膜中TGF-αmRNA的表達明顯增強,6 h-48h最強,72 h有所下降,仍高于正常對照組。PAF受體拮抗劑預防組和治療組TGF-αmRNA的表達48 h恢復正常。免疫組化證實了胃黏膜pS2、TGF-α表達變化。 結(jié)論 1.腹腔注射內(nèi)毒素可致幼年大鼠急性胃黏膜損傷,胃黏膜上皮細胞、壁細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化;PAF受體拮抗劑可明顯減輕內(nèi)毒素血癥時幼年大鼠急性胃黏膜損傷,由此得出PAF可能是引起幼年大鼠內(nèi)毒素血癥時急性胃黏膜損傷的重要因素。 2.內(nèi)毒素血癥時胃黏膜COX-2 mRNA、iNOS mRNA表達上調(diào),COX-2、iNOS蛋白表達增強。PAF受體拮抗劑可改善COX-2的表達,下調(diào)iNOS表達水平,在減輕急性胃黏膜損傷的同時可能有助于胃黏膜損傷的愈合。 內(nèi)毒素血癥時胃黏膜PGE_2下降,NO含量增高,誘發(fā)急性胃黏膜損傷;PAF受體拮抗劑可影響胃黏膜PGE_2濃度、NO含量,有助于其發(fā)揮對胃黏膜的保護作用。 3.內(nèi)毒素血癥時胃黏膜PCNA表達減少,胃黏膜損傷恢復PCNA表達也增加;胃黏膜pS2 mRNA、TGF-αmRNA表達上調(diào),pS2、TGF-α蛋白表達增強,可能通過介導細胞增殖參與急性胃黏膜損傷的保護和修復。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R725.7

【參考文獻】

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本文編號：2614154