【摘要】：目的: 1、建立一種多重PCR體系,同時(shí)檢測(cè)細(xì)菌氨基糖苷類抗生素7種耐藥基因aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ、ant(30)-Ⅰ、aph(3')-Ⅳ、armA和rmtB,通過(guò)對(duì)56份臨床分離的肺炎克雷伯桿菌株的耐藥基因檢測(cè),評(píng)價(jià)該多重PCR體系的臨床應(yīng)用。 2、建立一種多重逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法,分型檢測(cè)引起人手足口病的9種常見的人腸道病毒——人腸道病毒71型(HEV71)、柯薩奇病毒A組(CVA)16、4、5、9、10型和柯薩奇病毒B組(CVB)1、3、5型,通過(guò)對(duì)180份臨床糞便標(biāo)本手足口病原的檢測(cè),評(píng)價(jià)該多重RT-PCR體系的臨床應(yīng)用。 方法: 1、多重耐藥基因檢測(cè)體系的建立及臨床應(yīng)用評(píng)價(jià) (1)查詢各靶基因序列,經(jīng)ClustalX比對(duì),選擇保守區(qū)設(shè)計(jì)多重引物; (2)收集氨基糖苷類抗生素耐藥菌株,提取細(xì)菌基因組DNA;(3)單重PCR驗(yàn)證各對(duì)引物特異性,建立GeXP多重檢測(cè)體系,以已知陽(yáng)性混合模板驗(yàn)證多重檢測(cè)體系的特異性;(4)優(yōu)化反應(yīng)體系,以各陽(yáng)性基因的克隆質(zhì)粒對(duì)該檢測(cè)體系靈敏度進(jìn)行分析;(5)用此檢測(cè)體系對(duì)臨床上分離的56株氨基糖苷類抗生素耐藥的肺炎克雷伯桿菌進(jìn)行篩查,觀察各種基因的分布情況,并與傳統(tǒng)單重PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果比較,觀察兩種方法的一致性,對(duì)該多重體系的臨床應(yīng)用進(jìn)行評(píng)價(jià)。 2、手足口病病原譜分型檢測(cè)體系的建立及臨床應(yīng)用評(píng)價(jià) (1)選取1對(duì)針對(duì)腸道病毒5’UTR區(qū)設(shè)計(jì)的通用引物PE,和10對(duì)針對(duì)于9個(gè)血清型腸道病毒VP1區(qū)設(shè)計(jì)的特異性引物,建立GeXP多重RT-PCR檢測(cè)體系;(2)使用已知血清型的腸道病毒細(xì)胞培養(yǎng)物分析GeXP多重RT-PCR檢測(cè)體系的特異性;(3)以TCID50定量的細(xì)胞培養(yǎng)物和克隆質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄的RNA梯度稀釋液分析多重檢測(cè)體系的靈敏度;(4)對(duì)180份臨床糞便標(biāo)本進(jìn)行盲篩,并與毒株分離法、血清抗體中和試驗(yàn)和單重RT-PCR測(cè)序分析法匯總結(jié)果對(duì)照,評(píng)價(jià)GeXP多重RT-PCR腸道病毒分型檢測(cè)體系的臨床應(yīng)用。 結(jié)果: 1、成功建立一種基于GeXP系統(tǒng)的多重PCR檢測(cè)體系,同時(shí)檢測(cè)7種氨基糖苷類抗生素耐藥基因,檢測(cè)靈敏度達(dá)10拷貝。GeXP多重PCR篩查56株肺炎克雷伯桿菌臨床分離株,aac(3)-Ⅱ, aac(6')-Ⅰb, ac(6')-Ⅱ, ant(30)-Ⅰ, aph(3')-Ⅳ, armA和rmtB陽(yáng)性率分別為71.43%,25.00%,14.29%,75.00%,17.86%,71.43%和30.36%。以傳統(tǒng)單重PCR同時(shí)檢測(cè)56株肺炎克雷伯桿菌臨床標(biāo)本,GeXP多重PCR檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度為83.33%～100%,特異性為85.71%～100%,與傳統(tǒng)檢測(cè)方法有較高一致率。 2、成功建立一種基于GeXP系統(tǒng)的多重RT-PCR檢測(cè)體系,可同時(shí)擴(kuò)增出人腸道病毒共有的保守片段的和型特異性片段。優(yōu)化后的多重檢測(cè)體系檢測(cè)HEV71和CVA16細(xì)胞培養(yǎng)物的靈敏度達(dá)到100.05 TCID50,并可同時(shí)檢測(cè)出其它7種腸道病毒RNA,其靈敏度為100拷貝。檢測(cè)分析180份臨床標(biāo)本,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GeXP多重RT-PCR體系在檢測(cè)PE、HEV71和CVA16的靈敏度分別為98.79%、91.67%和91.67%,特異性分別為80.00%、98.48%和100%,其他7個(gè)血清型檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)分型方法匯總檢測(cè)結(jié)果一致率為92.59%(25/ 27)。 結(jié)論: 1、成功建立了基于GeXP系統(tǒng)的多重PCR檢測(cè)體系,快速、靈敏地篩查氨基糖苷類抗生素7種耐藥基因,該多重PCR檢測(cè)體系與傳統(tǒng)單重PCR具有較高一致性,可用于氨基糖苷類抗生素耐藥基因的快速篩查。 2、成功建立了基于GeXP系統(tǒng)的多重RT-PCR體系,快速、靈敏、特異地檢測(cè)引起手足口病的9種常見腸道病毒,該方法與傳統(tǒng)病毒分型方法有較高一致性,可用于手足口病病原譜的分子流行病學(xué)調(diào)查。
【圖文】：

同時(shí)采用毛細(xì)管電泳讀取技術(shù)，因進(jìn)行有效分析。第四，高靈敏度。Gen因特異性引物和通用引物，將多重 PCR基因的比例得以維持。這一策略克服了解決了多重偏愛擴(kuò)增的問(wèn)題，大大提高快速自動(dòng)設(shè)計(jì)。引物及擴(kuò)增片段經(jīng) Blast備選引物，并重新對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)或做。而且，該設(shè)計(jì)模塊在 Primer3 基礎(chǔ)上增論上不會(huì)產(chǎn)生引物二聚體等問(wèn)題。010000200003000040000500006000070000150 175 200 225 250 275 300 325RoRef ARR.D03_050919087NSize (nt)152.43157.71162.61168.01173.72178.09184.11188.84197.58203.36206.55214.20219.00224.24227.77233.32238.36247.22255.27258.85264.28268.74275.21295.46325.295’3’3’特異性嵌合引物

結(jié) 果立多重耐藥基因檢測(cè)體系物驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果株已知陽(yáng)性基因的肺炎克雷伯桿菌基因組 DNA 單重引物電泳，結(jié)果顯示 7 對(duì)引物均可分別擴(kuò)增出特異性目的條帶圖 1 所示。PCR 產(chǎn)物雙向測(cè)序結(jié)果拼接后輸入 NCBI BL結(jié)果與 GENBANK 公布序列吻合，說(shuō)明各對(duì)引物特異性好
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R725.1

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 盧昌;吳國(guó)華;顏新敏;趙志荀;李應(yīng)國(guó);聶福平;張強(qiáng);;GeXP多重基因表達(dá)分析系統(tǒng)及其應(yīng)用[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2013年02期

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本文編號(hào)：2613627